膀胱癌细胞特征性糖蛋白质和糖链的定量组学分析

Bladder cancer is one of the most common malignant cancers in urology. There are over 350,000 new cases each year in the worldwide scale. And the recurrence rate of the bladder cancer was up to 60-70%. Currently, the specificity and sensitivity of the tumor biomarkers of bladder cancer were lower. The diagnoses of bladder cancer were always in the late stage, resulting in a low cure rates. From the references and our previous works, the glycoproteins play an important role in the process of development and metastasis of cancers. Thus, glycoproteins have been widely used in the discovery of diagnostic biomarkers in early stage of cancer. Now, there were few reports on discovery of glycoprotein and their glycan biomarker in bladder cancer. This project will ascertain the alteration of glycoproteins and their glycans in the bladder cancer cells and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) bladder epithelial cells using lectin microarrays, lectin affinity separation, stable isotope label and quantitative analysis by mass spectrometry. The alteration of the glycoproteins and glycans will be validated in different stages of clinical tissues and urine samples. This study can reveal the mechanism of the bladder cancer. It also can facilitate the discovery of the cancer biomarkers in the early stage and to screen the target molecule in the cure of the bladder cancer.

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新增患者数目超过350,000名，且经治愈后的复发率高达60-70%。目前用于膀胱癌诊断的肿瘤标志物特异性差且发现较晚，导致膀胱癌的治愈率更低。文献和申请人以往的研究工作表明糖蛋白质在肿瘤发生发展以及转移过程中扮演着重要的角色，被广泛用于多种肿瘤早期诊断标志物发现的研究，目前关于膀胱癌糖蛋白质及糖链结构的研究则较少，且均为定性分析。本项目拟采用凝集素芯片，凝集素亲和分离，稳定非放射性同位素标记和质谱等定量分析技术，以不同转移潜能膀胱癌细胞为研究对象，并通过建立上皮间质转化（EMT）模型，寻找膀胱癌发生，发展以及转移过程中的标志性糖蛋白质和糖链结构，并通过临床组织和尿液样本进行验证。该研究对揭示膀胱癌发病机制具有重要意义，为膀胱癌早期诊断标志物的发现和临床治疗靶标的筛选提供相关的理论依据。

膀胱癌是世界范围内排名第四位的最常见实体瘤，也是国内最常见的泌尿系统肿瘤之一。在肿瘤形成的早期，细胞的很多蛋白质糖基化修饰就发生了明显的变化，这种变化与恶性肿瘤细胞发生转移时的信号传导密切相关，因此肿瘤早期细胞分泌的糖蛋白质可以作为临床诊断的生物标志物。近年来糖组学技术被广泛应用于多种癌症发病机制和标志物发现的研究中，利用糖组学技术也发现了多种与癌症发展密切相关的糖蛋白质或者糖链。本课题分别以人正常膀胱上皮细胞HCV29和HUCV1、非肌层浸润性膀胱癌细胞KK47和浸润性膀胱癌细胞YTS1，J82和T24为研究对象，以凝集素芯片技术，同位素苯胺标记糖链技术和细胞培养的稳定同位素标记（SILAC）以及质谱定量分析等技术为手段，寻找不同转移潜能膀胱癌细胞之间中特征性的糖蛋白质及糖链结构。并通过检测临床膀胱癌组织和尿液样本，验证特征性糖蛋白质及糖链水平。通过本研究发现有十种凝集素识别的糖蛋白质的糖链结构在膀胱癌发生过程中有显著的变化。从 6 株细胞中共鉴定出 52 种N-连接糖链结构，定量分析发现唾液酸化、岩藻糖化的N-连接糖链在膀胱癌肿瘤细胞恶化过程中呈现显著升高的趋势，同时平分型糖链和高甘露糖型N-连接糖链也呈表达升高趋势。SILAC定量蛋白质组学共鉴定到3721种特异蛋白质。归一化分析后发现，分别有110和87种蛋白质在KK47和YTS中相比HCV29细胞中有显著差异。以人正常膀胱上皮细胞HCV29、非肌层浸润性膀胱癌细胞KK47为研究对象，用TGF-β诱导膀胱上皮细胞发生EMT，SILAC定量蛋白质组学研究发现从HCV29细胞EMT前后鉴定到4649种特异蛋白质，从KK47细胞EMT前后鉴定到4817种特异蛋白质。分别有48和106种蛋白质在HCV29细胞EMT前后中有显著差异，分别有32和12种蛋白质在HCV29细胞EMT前后中有显著差异。