肝细胞源性HMGB1激活Kupffer细胞分泌IL-23募集IL-17A+γδT细胞介导急性肝功能衰竭的作用机理

Bioartificial liver (BAL) is a safe and effective therapeutic modality for patients with end-stage liver diseases. The inevitable trend for BAL development nowadays is to suppress immuno-inflammatory response, which provokes the conversion of BAL from passive support to active intervention. The applicants conducted a preliminary study indicating that ALF may result in a significant elevation of high motility group box 1 (HMGB1) expression together with its receptor TLR4, as well as downstream IL-23 in rat serum and liver tissues, which activated IL-17A+γδT recruiting neutrophils into diseased regions. Therefore, we suppose that acute liver failure is mediated by IL-17A+γδT cells which were recruited by kupffer cells-secreting IL-23 through hepatic HMGB1. The present project aim to unravel the precise HMGB1-secreting cells and its expression regular patterns; clarify the mechanisms of HMGB1 and TLR4 mediated signal transduction; and verify the role of IL-23-secreting Kupffer cells in recruiting neutrophils by activating IL-17A+γδT cells. If successful, the present project will provide a molecular target for configurating a brand-new BAL system with dual functions of supporting liver functions and intervening immuno-inflammatory reaction. In addition, our results would help to lay the experimental foundation for the enrichment and development in modern idea of ALF combined treatment.

生物人工肝（BAL）是终末期肝病患者一种安全、有效治疗途径。抑制免疫炎症反应是BAL由被动支持向主动干预转变的必然趋势。项目申请人前期初步发现急性肝功能衰竭（ALF）大鼠血清及肝脏高迁移率族蛋白1（HMGB1）明显增高，Kupffer细胞中HMGB1受体TLR4及下游产物IL-23表达随之升高，似活化IL-17A+γδT细胞趋化中性粒细胞浸润。因此，我们推测"肝细胞源性HMGB1可能激活Kupffer细胞分泌IL-23募集IL-17A+γδT细胞介导急性肝功能衰竭"。本项目拟揭示启动ALF免疫炎症反应的HMGB1来源与表达规律，阐明HMGB1启动Kupffer细胞TLR4下游信号转导机制，并明确IL-23分泌型Kupffer细胞活化IL-17A+γδT细胞趋化中性粒细胞的作用。本项目为构建兼具支持和干预双重治疗作用的BAL提供潜在分子靶点，也为丰富和发展ALF现代综合治疗理念提供实验依据。

急性肝功能衰竭是一类死亡率极高的综合征候群。生物人工肝（bioartificial liver, BAL）支持系统已成为延长急性肝功能衰竭患者生命，并向肝移植手术过渡的一种替代性治疗手段。如何获得更接近正常人肝细胞功能、对人体无害且足够数量的肝细胞历来成为BAL领域的研究热点。前期研究证实共培养是肝细胞大规模、高活性培养并最终应用于BAL的理想培养方式。本课题首先采用比较蛋白质组学方法找到大量与间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）共培养下的原代肝细胞内差异表达的蛋白质，两组间差异表达量≥3倍的蛋白质点共40个，其中表达上调的19个。经质谱鉴定出34个蛋白点，Western Blotting检测证实CFTR、IL-6、HMGB1变化水平与蛋白质组结果基本一致。这些功能蛋白的差异表达可能与MSCs和原代肝细胞体外共培养下肝细胞特异性功能改善、细胞生存时间延长、免疫调节密切相关。随后，观察骨髓MSCs共培养的肝细胞是否能够耐受慢加急性肝功能衰竭患者血清的细胞毒性，以及共培养细胞对肝衰血清的肝功能支持作用。结果发现骨髓MSCs共培养后的肝细胞在60%浓度的肝衰竭血清中肝细胞贴壁数量最多，呈岛状聚集生长。肝细胞表达白蛋白水平最佳（P<0.05），G2-S期细胞比例升至32.08%，细胞内超微结构接近正常，细胞活力较对照组明显改善，表明与骨髓MSCs共培养的肝细胞可耐受中高浓度慢加急性肝功能衰竭血清的细胞毒性，有效维持肝细胞功能的支持作用。第三部分观察了MSCs转染sRAGE基因后对急性肝功能衰竭免疫炎症反应的抑制作用。检测发现HMGB1组和EP组外周血生化水平较对照组明显上升，EP组较HMGB1组各肝功能水平明显下降。光镜下观察发现HMGB1组和EP组肝细胞坏死、肿胀、淤血及炎症细胞浸润程度较对照组明显加重。HMGB1组和EP组外周血TNF-α、IL-1、IL-6、HMGB1水平较对照组显著增加。EP组较HMGB1组的外周血和肝脏组织中各相关炎症因子的表达水平显著降低。sRAGE组外周血中生化等水平较ALF组和HMGB1组显著下降。本研究为今后治疗ALF提供了一种兼具支持和干预双重作用的BAL系统，为将HMGB-1靶向疗法应用于肝功能衰竭的综合治疗提供坚实的理论依据。