维生素E琥珀酸酯诱导人胃癌细胞凋亡过程中活性氧产生的机制及其作用研究

维生素E琥珀酸酯（VES）可诱导多种肿瘤细胞凋亡，本研究拟探讨VES处理人胃癌细胞后活性氧产生的机制及其在胃癌细胞凋亡中的作用。VES处理细胞后检测细胞内ROS、抗氧化酶及GSH含量，阐明细胞氧化应激状况；检测线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中关键酶活性，分别用抑制剂阻断各线粒体复合物，检测ROS含量，探讨细胞内ROS产生机制；淬灭或不淬灭ROS条件下检测线粒体膜ANT及VDAC表达，阐明ROS与mPTP开放的关系；淬灭ROS后检测线粒体膜电位，Bax、Bcl-2、VDAC、caspase-9/3蛋白表达，Bid裂解，Bax和细胞色素c迁移；用siRNA技术阻断Bid和BcL-2，或阻断Fas、DR4、DR5，检测细胞内ROS、GSH含量与VDAC表达，阐明ROS与线粒体、Bcl-2家族及死亡受体所介导的细胞凋亡信号通路之间的关系。该研究在探讨VES经氧化应激途径发挥抗肿瘤作用方面有所创新。

本研究探讨VES处理人胃癌SGC-7901细胞后ROS产生的机制及其在胃癌细胞凋亡过程中的作用。本研究按原计划完成，在跟踪文献的基础上部分内容做了必要的修订并有一定扩展。成果概括如下：（1）阐明了VES处理人胃癌细胞后对细胞氧化应激的影响。VES处理人胃癌细胞后ROS水平显著升高，而GSH水平及抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性均明显下降。(2) 阐明了VES处理胃癌细胞后ROS产生的机制。检测VES处理人胃癌细胞后线粒体复合物Ⅰ-Ⅳ（CⅠ-CⅣ）酶的活性，发现 CⅠ和CⅡ的酶活性显著提高。分别用线粒体复合物Ⅰ-Ⅳ的抑制剂ROT、TTFA、AA和SA处理细胞，发现CⅡ酶活性受到抑制时VES对细胞增殖的抑制水平显著降低，且细胞内ROS水平较VES单独处理组显著降低。提示ROS的生成主要是线粒体CⅡ发挥作用，且CⅡ中的SDH是VES诱导胃癌细胞凋亡的关键酶。检测与产生ROS密切相关的线粒体复合物酶构成基因表达，发现构成CⅡ的SDH亚基蛋白中 CybL mRNA表达显著提高，而FP、IP和CybS亚基蛋白无明显变化；在翻译水平上述4种亚基蛋白改变与转录水平变化趋势一致。TTFA抑制SDH酶活性后再用VES处理细胞，对CybL mRNA及蛋白表达的促进作用均被明显抑制，而对FP、IP和CybS 的表达没有影响。提示VES通过干扰SDH亚基蛋白CybL表达，影响SDH酶活性，造成线粒体中ROS堆积（3）阐明了ROS与mPTP开放在诱导肿瘤细胞凋亡过程中关系。VES处理肿瘤细胞后线粒体膜电位下降，线粒体内膜蛋白ANT和外膜蛋白VDAC1表达均增加，给ROS抑制剂后再用VES处理细胞，ANT与VDAC1表达比VES组明显下降，表明ROS对mPTP开放起促进作用。（4）阐明了ROS对线粒体介导的肿瘤细胞凋亡具有促进作用。VES处理细胞后，细胞色素C、caspase-3蛋白表达增加，而survivin蛋白表达下降。当给ROS抑制剂后用VES处理细胞，对上述蛋白表达的变化均有显著抑制作用。（5）阐明了ROS对Bcl-2家族介导的肿瘤细胞凋亡具有促进作用。抑制ROS后用VES处理胃癌细胞，Bax表达水平显著低于VES单独处理组，而Bcl-2表达明显增加。（6）提出VES诱导的肿瘤细胞氧化应激可能与内质网应激有关，VES也可通过内质网应激诱导人胃癌细胞凋亡。