维生素E琥珀酸酯诱导胃癌细胞凋亡过程中内质网应激与氧化应激的交互作用

申请者前期工作表明维生素E琥珀酸酯(VES)除通过内、外源信号途径诱导人胃癌细胞凋亡外，还可启动氧化应激反应，产生活性氧（ROS）及引起细胞外钙内流等。鉴于内质网应激(ERS)和氧化应激均与钙离子稳态有关，推测VES诱导胃癌细胞凋亡过程中ERS和氧化应激可能有关。本研究拟通过检测胃癌细胞ERS标志物GRP78、GRP94、CHOP及细胞Ca2+水平等阐明VES是否诱导胃癌细胞发生ERS；通过检测未折叠蛋白反应信号分子PERK、XBP1、ATF-6和凋亡相关分子caspase-4等探讨ERS在VES诱导胃癌细胞凋亡过程中的作用及机制；通过阻断胃癌细胞ERS信号分子检测VES处理后细胞ROS和谷胱甘肽含量等及淬灭ROS后检测ERS标志分子表达水平，探讨VES诱导胃癌细胞凋亡过程中ERS与氧化应激的交互作用。该研究将进一步阐明VES诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制，并为探索肿瘤防治新方案提供科学依据。

本研究以SGC-7901细胞为研究模型，探讨VES是否引起胃癌细胞发生内质网应激及其对细胞凋亡的影响，并阐明在VES诱导胃癌细胞凋亡过程中内质网应激与氧化应激的交互作用及其机制。 成果概括如下：（1）阐明了VES能够诱导胃癌SGC-7901细胞发生凋亡，DAPI荧光染色可见典型的形态学改变。（2）明确了VES可诱导胃癌SGC-7901细胞发生内质网应激。电子透射显微镜的结果显示，5μg/mLVES处理组内质网明显扩张、肿胀。蛋白印迹和RT-PCR的结果发现，20 μg/mL VES作用人胃癌SGC-7901细胞后，内质网应激标志物GRP78和GRP94 mRNA及蛋白水平表达均增高。（3）VES通过活化未折叠蛋白反应的信号转导通路激活ERS相应的凋亡分子，进而诱导细胞凋亡。随着作用剂量和作用时间的延长，在翻译水平上VES对内质网膜上的跨膜蛋白PERK磷酸化及ATF6活化片段的诱导作用不断增强；在转录水平上，VES对ATF4 mRNA的诱导作用也具有剂量依赖关系，而且XBP1 mRNA从VES作用6 h即开始出现剪切。VES明显促进caspase-4的裂解和JNK的磷酸化，具有剂量依赖关系和时间依赖关系，并在转录和翻译水平上显著诱导CHOP的表达。（4）阐明了VES可诱导人胃癌细胞发生氧化应激。VES能够增加SGC-7901细胞内ROS含量和钙离子水平，降低细胞内GSH含量及CAT、SOD和GPX的活性。.（5）阐明了VES处理胃癌细胞过程中内质网应激和氧化应激具有交互作用。NAC淬灭SGC-7901细胞内ROS后，20 μg/mL VES对GRP78和CHOP mRNA及蛋白表达的促进作用均被显著抑制。siCHOP干扰阻断CHOP表达后，与单纯VES处理组相比，细胞内ROS含量显著降低、GSH含量和GPX mRNA表达水平明显提高，而CAT和SOD mRNA水平无明显变化。 （6）提出ASMase参与了VES抑制细胞增殖以及促进细胞凋亡的过程。抑制ASMase后，被VES上调的GRP78、GRP94、p-PERK、CHOP表达以及被活化的Caspase-4表达均降低。（7）提出NF-κB参与了VES诱导胃癌细胞凋亡的过程。（8）进一步发现VES可诱导胃癌细胞发生保护性自噬，并且与内质网应激存在交互作用。