以IPS作为供体细胞进行核移植后表观遗传学研究

诱导多能性干细胞（IPS）已被证实在体内外具有多分化潜能，通过使用正常囊胚和四倍体胚胎途径均能参与形成生殖性嵌合体。但对于IPS是否具有ES细胞的所有生物学特征和功能仍有诸多疑问，如IPS细胞作为供体细胞制备克隆动物，虽经多方尝试，至今还没有成功，对其原因也不得而知。因而科学家利用IPS的来进行基因定向修饰并通过核移植途径生产基因打靶大动物的设想无法完成。用本研究拟将体细胞诱导为iPS细胞，然后将iPS再分化成为体细胞。这样原始体细胞、IPS细胞及IPS分化的体细胞在遗传上完全一致而表观遗传学状态不同。然后将这三种细胞作为供体核构建核移植胚胎，利用分子生物学手段研究不同发育阶段重构胚的基因表达和表观遗传学重编程的差异，探讨细胞表观遗传学重编程机制；并为打通利用IPS和核移植技术生产基因打靶大动物的技术路线奠定理论基础。

诱导多能性干细胞（iPS）已被证实在体内外具有多分化潜能，通过使用正常囊胚和四倍体胚胎途径均能参与形成生殖性嵌合体。但以iPS细胞作为供体细胞制备克隆动物，虽然经过多方尝试，课题申请时还没有成功的报道。这使科学家利用iPS来进行基因定向修饰并通过核移植途径生产基因打靶大动物的设想无法实现。本课题原计划现在小鼠上进行实验，以诱导iPS供体细胞、iPS、iPS随机分化细胞，这三种不同表观遗传学状态的细胞进行核移植，对克隆胚胎表观遗传学和基因表达差异进行探讨，再通过一定的干预措施获得iPS克隆小鼠，之后以在小鼠上确定的技术路线进行iPS克隆猪的制作。但在本课题申请后不久有两个实验室先后报道成功获得了iPS克隆小鼠，这说明以iPS为供体细胞是可以获得克隆动物的。因此在本课题实施过程中，我们直接对猪iPS为供体进行核移植获得克隆猪的可行性进行了研究。用于iPS 克隆猪研究的6 株iPS系由不同的实验室采用不同的诱导系统诱导而来。为了验证iPS经过核移植后能否获得iPS 克隆猪，首先，我们以未经任何处理的上述六株iPS 为供体细胞进行核移植，共构建克隆胚胎一万多枚，移植代孕受体70余头，但是均未获得发育到期的iPSC克隆猪，克隆胚胎在怀孕早期退化。与小鼠iPS不同的是，目前获得的这些iPS 外源基因均未沉默，我们推测外源基因的高表达可能是导致iPS克隆胚胎发育停滞的原因之一。因此我们将猪iPS进行随机分化，iPS（iPF4-2，iPM6-11）分化培养四天后外源基因表达显著降低，iPS 呈现分化状态。iPS（KSR-4，5%O2-1）分化培养后虽然形态已经呈分化状态，但外源基因表达并没有显著下降。我们以这种呈分化状态的细胞作为供体细胞进行核移植，其体外发育囊胚率较以未分化iPS 为供体细胞时有显著提高。将iPF4-2和KSR-4分化细胞核移植胚胎移植代孕受体后，iPF4-2分化细胞克隆胚胎能够发育到期，成功获得了存活iPS克隆胚胎。iPS克隆猪的获得为打通利用iPS和核移植技术生产基因打靶大动物的技术路线奠定了理论基础。