特异性抑制人疼痛相关离子通道Nav1.8的芋螺多肽的筛选、改造及镇痛作用研究

Voltage gated sodium channel subtype 1.8（Nav1.8）was mainly involved in inflammatory pain, neuropathic pain and transduction of nociceptive information. Compounds that specificly block Nav1.8 were expected to be developed into novel analgesic drugs. In our previous study, 421 novel conopeptide genes were identified from 18 Conus species, which inhabits South China Sea. 20 of the 421 conopeptides were speculated to have Nav1.8 activities by iCTX and molecular docking. In this study, in order to find Nav1.8 specific inhibitors, 20 conopeptides were synthesized by solid-phase peptide synthesis and the Nav1.1-1.8 activities were tested by patch clamp. Alanine-scanning, amino acid insertions and deletions and basic amino acid substitution were used to design conopeptide analogs, which were tested Nav1.8 activities to find more efficient analogs. NMR was used to study the structure of conopeptide. Three animal pain models were used to test the analgesic effects of conopeptide. Cell proliferation assay, cell apoptosis，rat behavioral observation and rat spinal cord tissue lesion were used to detect neurotoxicity of conopeptide. This study will provide analgesic drug candidates and ion channel probes.

电压门控钠离子通道亚型1.8（Nav1.8）主要参与炎症性疼痛、神经性疼痛和对伤害性刺激反应的信号传递，特异性阻断Nav1.8的化合物有望开发成新一类的镇痛药物。本项目前期从中国南海18种芋螺中克隆得到421种全新的芋螺多肽基因，并通过iCTX和分子对接模拟的方法预测得到可能作用于人Nav1.8的20种多肽。本项目拟通过固相化学合成的方法合成这20种芋螺多肽，利用膜片钳技术检测20种多肽对人8种钠离子通道亚型Nav1.1-Nav1.8作用（已完成1种多肽检测），筛选出特异性抑制人Nav1.8电流的多肽，并通过丙氨酸扫描、氨基酸的插入缺失和碱性氨基酸替代等方法改造多肽氨基酸序列，提高多肽抑制人Nav1.8活性，通过核磁共振解析多肽的空间结构，利用三种小鼠镇痛模型观察多肽治疗的疼痛类别及镇痛效果，通过细胞增殖、凋亡、大鼠行为学和脊髓组织病变检测多肽的神经毒性，为镇痛新药的研发奠定基础。

电压门控钠离子通道亚型1.8（Nav1.8）主要参与炎症性疼痛、神经性疼痛和对伤害性刺激反应的信号传递，特异性阻断Nav1.8的化合物有望开发成新一类的镇痛药物。芋螺毒素是海洋软体动物芋螺分泌的靶向各种离子通道的功能多肽，具有活性好和特异性高的优点。本项目从前期保存的中国南海芋螺基因资源库中挑选多肽序列，采用固相化学合成的方法成功合成了二硫键正确配对的20种多肽，并对多肽的活性进行了研究，筛选到1种作用于钙离子通道的多肽、7种作用于α7乙酰胆碱受体的多肽和1种作用于钠离子通道的多肽Ts3.1。深入研究Ts3.1的钠离子通道抑制活性，发现10uM的Ts3.1对大鼠背根神经节神经元上的河豚毒素敏感型钠电流没有抑制作用，而对河豚毒素不敏感型钠电流有较大抑制作用，抑制率为72.92%。进一步实验发现Ts3.1对大鼠背根神经节神经元上河豚毒素不敏感型钠电流的抑制半数有效剂量为2.61uM。10uM的Ts3.1对人钠离子通道亚型Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6和Nav1.7电流都没有明显抑制作用，而对人Nav1.8电流有明显抑制作用，抑制率为75.07%。进一步发现Ts3.1对人Nav1.8电流的抑制半数有效剂量为2.11uM，而且2uM的Ts3.1对钠离子通道的激活曲线、失活曲线都没有明显影响。对Ts3.1的改造实验发现，将第15位的精氨酸突变为丙氨酸后，突变体的Nav1.8通道抑制活性丧失，表明第15位的精氨酸是抑制钠通道活性的关键氨基酸。插入突变实验发现，在第二个半胱氨酸环上插入一个色氨酸后，多肽对Nav1.8的抑制活性显著降低，同时产生钙离子通道的抑制活性，10uM的插入突变体对大鼠背根神经节神经元上钙离子电流的抑制率为47.36%，表明第二个半胱氨酸环上插入色氨酸降无法提升多肽的Nav1.8通道抑制活性，但却可以增加钙离子通道抑制活性。Ts3.1的圆二色谱显示其空间结构中含有β折叠。小鼠的镇痛热板实验发现，Ts3.1作用2小时将小鼠的痛阈值提高155%，高于阳性药齐考诺肽的106%，并且在相同浓度下未产生明显的副作用。以上研究表明，本项目发现的多肽Ts3.1具有特异性抑制人Nav1.8通道电流的活性，并且在小鼠体内具有明显的镇痛效果，为新型镇痛药的研发奠定了基础。