核外ATM蛋白在脂蛋白内吞过程中的作用及机制

核外ATM蛋白在细胞囊泡运输及蛋白质转运过程中起重要作用。前期工作证实ATM杂合子(ATM+/-)突变可降低乳糜微粒残粒(CRs)清除而显著增高apoE缺失鼠血浆胆固醇水平,改变肝细胞CRs内吞过程中形成的胞浆内涵体蛋白质组的表达，降低其ATM蛋白含量，减少CRs摄取，促进As形成。本研究拟采用共聚焦激光扫描显微镜、免疫沉淀结合质谱分析等方法分析ATM蛋白在肝细胞核外亚细胞组分中的分布及含量，明确核外ATM蛋白介导CRs内吞过程中可能作用的亚细胞部位，获得细胞核外与细胞内吞过程中相关的ATM结合蛋白及相互作用的蛋白质种类及性质,观察核外ATM蛋白对CRs内吞过程的影响，以期阐明核外ATM蛋白在CRs内吞过程以及As形成中的作用及机制。阐明这些问题对深入认识核外ATM蛋白的作用和功能以及指导ATM+/-携带者As的防治工作具有十分重要的理论价值和临床意义。

ATM蛋白主要以无活性的多聚体存在于细胞核中，但核内ATM蛋白的功能尚难以完全解释ATM蛋白缺失所表现的与动脉粥样硬化相关的一些病理特征如高胆固醇及甘油三酯血症等。目前认为核外ATM蛋白在细胞囊泡运输及蛋白质转运过程中起重要作用，但其在肝细胞脂蛋白残粒转运及代谢中的作用及机制尚未阐明。本实验采用密度梯度超速离心分离溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、内涵体等亚细胞器及胞浆膜，利用双向差异荧光电泳、蛋白免疫印迹及免疫共沉淀等方法分析ATM蛋白在肝亚细胞组分中的分布，明确核外与ATM结合及相互作用的蛋白，并探讨其在肝细胞脂质代谢中的作用，以阐明核外ATM蛋白在脂蛋白内吞过程中的作用及机制。实验结果显示，ATM基因缺失，apoE-/-小鼠肝细胞对脂蛋白残粒结合没有明显影响，但可显著降低肝细胞对脂蛋白残粒的摄取，明确了ATM缺失时apoE-/-小鼠血浆脂蛋白增高的原因。双向差异荧光电泳分析提示apoE-/-/ATM+/-小鼠早期及晚期内涵体蛋白与apoE-/-/ATM+/+小鼠比较有19种蛋白存在一定差异，其中13个蛋白在apoE-/-/ATM+/-小鼠表达减少甚至不表达，蛋白免疫印迹分析证实肝脏早期及晚期内涵体中均含有ATM蛋白，提示胞浆中ATM蛋白可能参与脂蛋白的内吞及代谢过程。免疫共沉淀显示胞浆中PI3K蛋白是ATM的结合蛋白，同时溶酶体、过氧化物酶体、线粒体中均存在有ATM蛋白和PI3K蛋白表达，激活胞浆中ATM蛋白，胞浆中PI3K蛋白活性明显增加，表明PI3K蛋白可能是ATM蛋白在脂蛋白内吞及代谢过程中的相互作用蛋白。而用ATM蛋白激活剂氯喹激活胞浆中ATM蛋白能增加肝细胞对脂蛋白残粒的摄取，抑制PI3K蛋白活性，则能明显减弱其对脂蛋白残粒的摄取，进一步证实ATM蛋白通过PI3K而介导脂蛋白残粒内吞及其代谢作用。通过以上实验研究明确了肝细胞核外ATM蛋白亚细胞分布，证实了PI3K是核外ATM 结合及相互作用的蛋白，并初步阐明ATM蛋白通过PI3K而参与肝细胞脂蛋白残粒内吞及其代谢的作用机制，为明确动脉粥样硬化的发病机制及防治ATM＋/-携带者动脉粥样硬化的发生奠定了基础。