丙酮酸激酶M2琥珀酰化修饰抑制非小细胞肺癌细胞生长的机制探索

It was reported that the function of PKM2 was regulated by several posttranslational modifications: acetylation, phosphorylation and oxidation. In this study, we identified succinylation as a new modification of PKM2 and K311 is the main succinylation site. Succinylation inhibits lung cancer cell growth via down regulation of PKM2 activity. To further confirm this conclusion, we did the xenographt experiment which proved that succinylation of PKM2 inhibits the growth of lung cancer in vivo. In addition, we also identified the desuccinylase of PKM2:Sirt5. These results indicate that PKM2 is a potential target of clinical lung cancer therapy and provide a possibility that we can inhibit the growth of lung cancer via inhibition of Sirt5 and increasing the succinylation level of PKM2. In the later research, we will focus on the mechanism research of succinylation regulation of PKM2 in lung cancer growth.

目前已报导的关于PKM2的翻译后修饰有:乙酰化,磷酸化及氧化,我们前期的研究发现PKM2还受到另外一种修饰-琥珀酰化的调控，并且确定了琥珀酰化的位点：K311。琥珀酰化通过K311抑制其活性，从而抑制肺癌细胞的生长。为了进一步说明PKM2琥珀酰化修饰对肺癌细胞生长的影响，我们又做了裸鼠异种移植实验，结果进一步证实PKM2的琥珀酰化确实可以抑制肺癌细胞的生长。我们还发现了PKM2的去琥珀酰化调控酶：Sirt5。这些研究结果提示PKM2可以作为一个肺癌治疗的潜在靶点，我们还可以通过抑制其去琥珀酰化调控酶Sirt5来增加其琥珀酰化水平，从而达到抑制肺癌细胞生长的目的。在后续的研究中，我们将进一步扩大样本量进行验证，并致力于琥珀酰化通过抑制PKM2来抑制肺癌细胞生长的具体机制的研究。

PKM2可以被磷酸化的酪氨酸负调控，从而积累糖酵解中间产物用于合成代谢，满足肿瘤细胞快速生长的需要，促进肿瘤的生长。研究发现PKM2是一个具有多种功能的蛋白，除了调控糖酵解，积累中间产物用于合成代谢的功能外，PKM2还具有一系列新功能：PKM2激活其下游基因GLUT1，LDHA和PDK1的转录，使葡萄糖主要通过糖酵解代谢，产生更多的乳酸，即Warburg效应；PKM2被表皮生长因子（EGF）激活后，可共激活子上调癌基因c-Myc和细胞周期蛋白cyclin D1，促进肿瘤生长；PKM2的358位半胱氨酸被活性氧（ROS）氧化后可抑制其酶活，从而产生更多的还原力（NADPH）用于肿瘤细胞的抗氧化；PKM2的同源二聚体具有蛋白激酶的活性，调控相关基因转录。.我们的研究发现：1、去琥珀酰化PKM2的SIRT5结合位点K498：我们将K498突变为K498E，并且进一步发现这种突变可以增加PKM2琥珀酰化表达52.6%。过表达SIRT5可以降低PKM2琥珀酰化的K498的表达水平来使用抗K498琥珀酰化抗体可以很容易的检测到野生型PKM2，但是却无法检测到K498突变的PKM2；2、K498位点的琥珀酰化可以增加PKM2的活性：将PKM2的K498位点的K突变至具有琥珀酰化功能的E时，可以提高PKM2活性2.2倍，进一步检测了SIRT5敲除的293T细胞的PKM2水平，并且发现当敲除了SIRT5可以增加PKM2活性79%。相反的当SIRT5过表达的时候，PKM2的活性会被抑制；；3、PKM2的K498位点的琥珀酰化促进细胞的氧化损伤：当使用H202处理239T细胞的时候，PKM2的K498位点的琥珀酰化水平会降低，伴随着琥珀酰化水平的降低，PKM2活性也随之降低；4、通过PKM2 K498去琥珀酰化，可以抑制SIRT5并进一步抑制肿瘤细胞的增生：我们发现在A549细胞中敲除SIRT5后，和对照组的细胞相比，可以明显的抑制肿瘤细胞的增生。.项目完成了对于PKM2琥珀酰化机制的初步探索，确立了明确的突变位点K498，并且PKM2的去琥珀酰化调控酶：Sirt5。可以进一步的促进对于肺癌PKM2通路的表观遗传学领域的研发工作，可以进一步的明确定向抑制PKM2的化合物的研究，为该靶点的药物研发工作提供基础和方向。