新活化分子ZCH-2B8a抗原的鉴定及在T细胞免疫应答中的功能

活化分子在T细胞免疫应答及调控中起重要作用，有很好的临床应用前景，现未见有活化分子介导T细胞摄取胞外蛋白的报道。ZCH-2B8a是本研究组在研制抗白血病干细胞单抗过程中制备所得，经HLDA-8鉴定性质未明。前期研究表明其识别的抗原是一早期、稳定的T细胞活化分子，具有介导抗体在不同温度下快速内化的能力。我们推测该抗原可能介导T细胞摄取胞外蛋白。为明确该抗原的属性及功能，本课题拟采用噬菌体展示技术克隆出2B8a抗原的基因序列，Edman降解法测定其氨基酸序列；通过对F-actin、dynamin及clathrin内化途径的抑制研究其介导内化的机制；并采用RNA干扰技术抑制T细胞2B8a抗原表达，观察抑制前后T细胞活化及摄取功能的变化。本课题将明确2B8a抗原序列，初步阐明其在T细胞免疫应答中的功能，为研究T细胞摄取行为与免疫应答及调控中的作用奠定基础，并可能发现新的CD分子和新的蛋白内化机制。

ZCH-2B8是本研究组在研制抗白血病单抗过程中获得的鼠抗人抗体，经国际人类白细胞分化抗原协作组（HLDA-8）鉴定性质未明。前期研究表明其识别的抗原是一早期、稳定的T细胞活化分子，具有介导抗体在不同温度下快速内化的能力。本课题中首先构建了Raji细胞的T7噬菌体cDNA文库，利用2B8a抗体对文库进行亲和淘洗，挑取噬斑进行基因测序，测序所得序列经比对后最为匹配的为NPIPB3，但该蛋白与2B8a抗原性质不相符。因此，我们通过蛋白途径进一步鉴定抗原。我们通过免疫共沉淀技术利用2B8a抗体从Raji细胞的蛋白裂解液中沉淀出2B8a抗原及其相互作用蛋白，二维电泳后将目的蛋白条带送混合蛋白经串联质谱分析后发现该抗原与coronin-1a匹配的可能性大。同时，利用2B8a抗体对噬菌体随机肽库进行筛选亦提示2B8a抗体所识别的抗原表位可能存在于coronin蛋白中。我们通过RT-PCR 法从Raji细胞中克隆出coronin-1a基因序列，插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中，转染CHO细胞以表达该蛋白，发现转染coronin-1a的CHO胞浆内2B8a抗体结合蛋白显著增加，提示2B8a抗体识coronin-1a。同时，通过对2B8a内化机制的研究发现，2B8a介导的抗体内化与细胞膜的功能密切相关，而与dynamin内化途径及F-actin的功能无明显关联。然后，我们利用人组织芯片分析了2B8a抗体的反应谱，发现该抗体仅与扁桃体、淋巴结、胸腺、脾脏和骨髓等淋巴器官反应，而与心脑肝肾等重要脏器均不反应，但该抗体与B系白血病细胞的反应性明显强于正常B细胞。此外，该抗体与活化T细胞相关的免疫性疾病患者外周血T细胞的反应性明显增强，同时可介导对B系肿瘤细胞和活化T细胞的杀伤，具有开发成为靶向药物的潜能。因此，我们利用通用引物从2B8a 杂交瘤细胞株中克隆出了2B8a 抗体的轻链和重链可变区序列，将用于单链抗体的构建和抗体人源化改造。该课题成功鉴定出2B8a抗体识别的抗原为冠蛋白coronin-1a，并发现该抗体具有用于靶向治疗B系血液肿瘤和自身免疫性疾病的潜能，为将该抗体开发成为肿瘤靶向药物奠定了基础。