运用单分子荧光踪迹方法研究DNA修复蛋白UvrA和UvrB的工作机理

UvrA and UvrB are components of nucleotide excision repair system which is one of primary pathways to remove DNA damage in bacteria. A unique feature of these proteins is the ability to recognize many DNA modifications vary broadly in chemical structure. The mechanism underlying actions of UvrA and UvrB remains unclear due to the complexity of reaction and limitation of traditional biochemical approaches. Single molecular methods emerged recently prove to be effective in dynamic and chemo-mechanical study of enzymes to provide details of reactions with high resolution and real time. Bearing in mind that seeing is believing, we have established a single molecular fluorescent experimental system in vitro and also in living cells to mimic reaction of UvrA and UvrB with DNA in real time with super-resolution fluorescence microscopy. The recorded fluorescent trajectories at single molecular level indicate movement of UvrA and UvrB labeled with fluorophore. The information of how UvrA and UvrB scan DNA substrates, how they locate a damage site and how they are interact with each other to accomplish their role are analyzed, integrated and extracted from the trajectories for deducing work principles of the two proteins. It is of great importance to elucidate mechanisms of UvrA and UvrB searching and recognizing DNA damages not only for understanding the fundamental biological roles to maintain stability of genome, but also for understanding the happening process of cancer and providing clues for chemotherapeutic drug design.

UvrA和UvrB蛋白为具有重要生物功能的DNA修复蛋白，具有识别和递呈种类繁多损伤位点的独特功能。由于其反应的复杂性和以往传统生化研究方法的局限性，到目前为止人们仍然对UvrA和UvrB的工作机理的很多方面不能理解。鉴于单分子研究方法具有实时动态、高精度、诠释细节等优点，近年来被证实为研究蛋白质分子个体生物功能的有效新方法，本研究设计了体外单分子实验体系和体内单分子荧光实验体系来模拟UvrA和UvrB分子在底物DNA分子上的实时扫描、确认损伤靶点的生化反应全过程，并对此过程进行超高分辨率单分子精度的荧光成像，然后对分子运动轨迹进行系统分析、拟合、建模，从而研究UvrA和UvrB在大量DNA底物中准确寻找少量损伤位点的搜寻机制，以及在此过程中两种蛋白的协同作用机制。对UvrA和UvrB工作机理的阐明不仅对基因稳定性深入理解，还对癌症发生机理及抗癌药物的开发等方面都具有重要的参考意义。

DNA处于细胞生命活动的中心位置，DNA损伤修复在维持基因组稳定和防止癌症发生等方面都具有重要意义。由于科学发展和研究手段局限，截至目前DNA损伤修复蛋白在体内具体工作机制还不清楚。本项目以原核生物大肠杆菌为主要研究对象，旨在通过体内和体外单分子荧光技术探索其DNA修复蛋白UvrA和UvrB的工作机理。本项目研究发现运用现有国际先进荧光标记和超高分辨率显微成像技术，还不能观测到活体大肠杆菌内UvrA和UvrB的运动情况，这和目前国内外尚无此方面研究报道的科研现状相一致。我们调整了观测内容，对活体大肠杆菌体内DNA的动态分布和组装盘绕状态进行探索研究，即对DNA修复蛋白的滑行轨道进行了研究。. 研究结果发现，大肠杆菌染色体DNA呈“双重螺线圈”方式盘绕在类核内。在不断生长分裂大肠杆菌体内，其染色体DNA呈现出周期性动态分布和演变规律。快速生长大肠杆菌其染色体DNA在一个复制周期内呈现“1-3-2”的螺线圈复制模式；最低营养条件下大肠杆菌染色体DNA呈现“2-1-3-2-4”的螺线圈复制模式。每个螺线圈中心被一个可激发荧光HNS-mEos2簇指示。在螺线圈外围DNA盘绕压缩程度小于中心区，中心区域DNA侧向被HNS彼此桥连，呈现出HNS核结合蛋白簇，外围区域有Hu、Fis和IHF蛋白等核结合蛋白广泛分布。本研究在国际上首次发现和报道了原核生物染色体DNA的盘绕组装模式，为解决生物学经典研究模型大肠杆菌的DNA组装分布之谜提供了有力证据，人们早在几十年以前已经用电镜观察到真核生物的染色质DNA和组蛋白构成的 “串珠”模式核小体，病毒的基因组DNA是紧密排布于衣壳内。相比之下，生物界另一大类原核生物，人们对其DNA组装方式至今未能观测到。本研究在国际上首次提出原核生物大肠杆菌染色体DNA在一个复制周期内具体三维的动态组装盘绕模式，创新地提出支配DNA大分子自发盘绕的动态平衡和能量最低原理，以新的理论和视角分析了染色体DNA在细胞内狭小空间高度有序自组装的潜在机理，深入了人们对生物体最基本的染色体DNA自组装现象的理解。此外，本项目为将来人们研究大肠杆菌DNA修复蛋白等以DNA为轨道的功能蛋白运行方式和分析拟合其单分子荧光轨迹，提供了必要的DNA轨道分布依据。