CD73非酶功能经EGFR/Akt通路调控宫颈癌细胞增殖迁移的作用及机制研究

Recently studies shows that CD73 play an important role in cancer progression. CD73 has dual enzymatic and non-enzymatic functions in cells. As a nucleatidase, CD73 catalyzes the hydrolysis of AMP into adenosine. However, the effect of non-enzymatic function of CD73 is not clear. Our pre-experiments found that CD73 overexpression could promote the proliferation and migration of cervical cancer cells. However, we found that this promotive effect of CD73 was independent with adenosine. And moreover, we found that the expression level of EGFR and Akt were increased in CD73 overexpression cells. The results suggest that CD73 promotes cervical cancer cells proliferation and migration through potentiating EGFR/Akt pathway, which is independent of CD73 enzyme activity. In this project, we will firstly indentify the effect of CD73 non-enzymatic function on cervical cancer cells proliferation and migration through constructing the CD73 and CD73mut overexpression cell models. CD73mut is the mutant of CD73 which deleted its enzyme activity by site-directed mutation (F417A & F500A); Secondly, we will investigate the effect and mechanism of CD73mut on EGFR/Akt pathway activity by using Luciferase report assay, immuno-precipitation assay and protein mass spectrometry analysis. Then, the data of cell experiment in vitro would be verification by using mouse models. we hope our research will clarify the role and mechanism of CD73 nonenzymatic function in cervical cancer growth and metastasis.

CD73在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。CD73具有水解酶和信号转导的双重功能，其水解酶功能介导酶促反应产生腺苷，信号转导功能的作用及机制尚不清楚。我们前期实验发现CD73过表达可促进宫颈癌细胞的增殖和迁移能力，然而这种促进作用呈现非腺苷依赖的特征，并且CD73过表达可上调EGFR/Akt表达水平，由此我们提出假设：CD73非酶功能通过调控EGFR/Akt通路促进宫颈癌细胞的增殖和迁移。本课题拟利用实验室前期筛选得到的CD73水解酶活性缺失突变体-CD73mut，构建CD73及CD73mut过表达细胞模型，检测细胞生物学行为变化，揭示CD73非酶功能对宫颈癌细胞的作用；然后利用荧光素酶报告系统、免疫共沉淀、蛋白质谱检测分析CD73调控EGFR/Akt通路的分子机制；最后构建动物模型，验证细胞实验结果。最终阐明CD73非酶功能经EGFR/Akt通路促进宫颈癌细胞增殖和迁移的作用及机制。

1 研究背景..恶性肿瘤发生发展机制复杂，影响因素众多，其中，细胞获得不可控的快速增殖能力，增强的迁移侵袭能力是关键。近年来的研究发现CD73对肿瘤细胞增殖迁移具有重要的调控作用。CD73是一种糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白，目前的研究表明，CD73具有双重功能: 1) 水解酶活性，CD73又被称为胞外5，-核苷酸酶(EC 3.1.3.5)，可介导酶促反应催化单磷酸腺苷（AMP）水解生成腺苷（ADO），腺苷可参与调节机体的免疫反应。2) 非酶功能/信号转导功能，除了水解酶活性之外，CD73还可以作为重要的信号转导分子参与调控细胞的粘附、迁移等行为，但是具体的作用机制尚不清楚。..我们前期研究发现，CD73过表达可促进宫颈癌细胞的增殖和迁移，然而这种促进作用呈现非腺苷依赖的特征，这提示CD73非酶功能作用关键，进一步实验发现，CD73与EGFR/AKT信号通路密切相关。我们提出假设：CD73非酶功能通过调控EGFR/Akt信号通路促进宫颈癌细胞的增殖和迁移。.2 主要研究内容..首先，我们构建过表达正常CD73以及CD73mut的宫颈癌细胞模型，通过对照细胞之间的比较，揭示CD73非酶功能对宫颈癌细胞增殖、迁移能力的作用；然后，通过实验研究CD73非酶功能对EGFR/Akt通路的调控作用及其作用机制；最后构建小鼠荷瘤模型，监测肿瘤生长、转移，鉴定CD73、CD73mut表达水平与动物模型成瘤时间，肿瘤生长速率以及转移状态的相关性，鉴定肿瘤组织、转移瘤组织中EGFR、pEGFR、Akt、pAkt表达水平，并根据细胞实验结果做相关的分子检测，验证细胞实验数据。.3 重要结果和关键数据..1）构建了CD73和突变型CD73过表达的宫颈癌细胞模型，通过细胞生物学表型实验，结果显示，CD73过表达（野生型和突变型）可以促进宫颈癌细胞的增殖。..2）揭示了CD73过表达对EGFR/AKT信号通路的激活作用，并利用EGFR/AKT的抑制实验，明确了EGFR/AKT在CD73过表达促进宫颈癌细胞增殖中的关键作用。..3）利用裸鼠移植瘤模型，体内验证了CD73过表达对宫颈癌生长的促进作用。.4 科学意义..本课题的实施揭示了CD73非酶功能在肿瘤发生、发展中的调控作用，对发掘以CD73为靶点的肿瘤治疗策略具有重要的参考意义。