基于cDNA文库基因测序及芯片分析技术的羟基红花黄色素A生物合成途径的研究

前期研究工作以特异性富集羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A ，HSYA)的红花花冠构建的均一化cDNA文库获得的unigene定制了红花原位杂交基因芯片；以课题组特有的不含HSYA的红花品系为对照，采用T-ANOVA方法分析了高HSYA品系花冠HSYA生物合成的时序性差异表达基因，通过KOBAS分析，获得了KEGG数据库中HSYA显著性富集的Pathway,并结合HSYA的化学结构，确定了HSYA可能的生物合成途径。本研究拟在此基础上，采用RACE技术系统克隆重要通路的关键基因，进而采用植物基因工程手段，构建单基因到多基因组装载体系统，以农杆菌介导，将克隆的基因转入红花再生受体,通过对转基因红花的分子生物学检测及HSYA的定量测定，进一步验证其通路的正确性，为HSYA的工业化生产以及红花品质的定向调控提供一条新途径，也为药用植物资源的合理开发利用提供新的思路。

本研究在前期确定羟基红花黄色素A（HSYA）可能的生物合成途径的基础上，通过RACE技术克隆出了16条与HSYA生物合成途径有关的全长基因，包括7条二酮戊二酸Fe（II）依赖加氧酶基因、4条糖基转移酶基因、2条查尔酮异构酶基因、3条查尔酮合酶基因。四个蛋白酶进行原核表达，CtF3H蛋白可催化柚皮素生成二氢山柰酚，CtCHI1可催化柚皮素查尔酮生成柚皮素，CtCHS1则可催P-coumaryol-COA和Malonyl-CoA生成柚皮素查尔酮。13条目的基因的真核表达载体（pMT39)被构建，通过LBA4404农杆菌侵染洋葱表皮细胞进行亚细胞定位，pMT39-CtACO1和pMT39-CtF3H的GFP荧光信号定位在细胞核，而pMT39-CtCHS2定位在细胞膜和细胞核。qRT-PCR检测两个化学型红花品系在100mM茉莉酸甲酯刺激下不同时间点功能基因的相对表达量，在Y品系中CtACO1、CtACO2、CtFLS4、CtF3H、CtCHS2基因的表达量提高，而CtCHS1基因的表达量则降低；W品系中CtCHS1基因的表达量提高，而CtACO1、CtACO2、CtFLS4、CtF3H、CtCHS2基因的表达量则降低。上述6个基因在两个品系中呈现了相反的响应模式。采用UPLC-QTOF/MS检测黄酮类代谢成分的变化：HSYA的积累量在MeJA刺激后呈现持续性上升，进一步表明CtACO1、CtACO2、CtFLS4、CtF3H、CtCHS2均正向调控了HSYA的生物合成。通过LBA4404农杆菌介导的花粉管导入法转化Y品系，首次成功获得了CtACO1基因过表达的转基因植株，其花冠中MYB12、CtPAL、Ct4CL、FNS、F3'H、F6H基因的表达量明显上升，而CHS1的表达量则明显下降，HSYA、红花素、山柰酚及其苷类的含量显著降低，槲皮素及其苷类成分的含量显著提高。综上所述，MYB12、CtPAL、CtCHS1、CtCHS2、CtFLS4、CtF3H、CtUGT2、CtUGT3基因是正向调控HSYA生物合成途径的功能基因，而CtACO1基因对HSYA的合成则起双向调控的作用，其表达水平在一定范围内有利于HSYA的积累。本研究结果为阐明红花HSYA的生物合成途径、定向调控红花的品质提供了重要科学依据。本研究成果形成科研论文9篇，其中已发表6篇，修回1篇，正在审稿2篇。