药油兼用红花品质形成的分子机制研究

In the preliminary work, The situ hybridization DNA microarrys was obtained with sequenced and annotated unigenes from the safflower transcriptome. The T-ANOVA analysis was used to get the time sequence differential expression genes using the high content of kaempferol-3-O-rutinoside and fatty acids uniquely possessed in our laboratory. The KOBAS analysis was used to find the significance biosynthesis pathways of these compositions. In this study, we attempted to get the total length sequences of the key genes of the hypothesis pathway by RACE technology and create the expression vectors using the plant genetic engineering methods. The key genes are imported to the regenerate acceptor of safflower by agrobacterium-mediated Gene transformation. The hypothesis pathways are validated by the molecular biology detections of safflower and the quantitative estimation of chemical composition with HPLC, UPLC-QTOF and GC-FID.The interaction among biosynthesis process of chemical composition is also analyzed. We aimed to interpret the molecular mechanisms and regulation network of oil available and medicinal value of safflower and find a new way to orientate regulation the quality and resource reasonable utilization of safflower.

前期工作以红花转录组进行基因测序和注释获得的unigene定制了红花原位杂交基因芯片；分别以课题组特有的高山奈酚-3-O-芸香糖苷及高脂肪酸含量的红花药用及油用品系花冠及果实不同生长时间点合成的cRNA与芯片进行杂交，采用T-ANOVA分析方法，锁定了山奈酚-3-O-芸香糖苷以及脂肪酸生物合成的时序性差异表达基因，获得了KEGG数据库中这些成分生物合成显著性富集的Pathway。本研究拟在此基础上，采用RACE技术，系统克隆红花品质形成重要通路的关键基因，进而采用植物基因工程手段，通过构建植物基因表达载体，以农杆菌介导，将克隆的基因转入红花再生受体，并通过对转基因红花株系的分子生物学检测、品质成分的HPLC、UPLC-QTOF、GC-FID测定及其生物合成过程之间互作关系的分析，最终确定药油兼用红花品质形成的功能基因及调控网络，为药油兼用红花品质的定向调控及红花资源的合理利用提供新途经。

本项目重点对参与药油兼用红花品质形成的重要功能基因查耳酮合酶基因CtCHS1，查耳酮异构酶基因CtCHI1，ACC氧化酶基因CtACO3和脂肪酸基因CtFAD2-10进行了研究。首次通过GV3101农杆菌介导的花粉管通道法转化红花Y品系，成功获得了转CtCHS1、CtCHI1和 CtACO3的过表达转基因植株。与对照组相比，CtCHS1过表达植株中CHS1上升了94.7%，PAL2、PAL3、4CL2、CHS4、CHS6也明显升高，而4CL1、4CL3、4CL5、DFR1和CHI2的表达量则明显下调。代谢组学分析显示，转基因植株中醌式查尔酮化合物HSYA和Carthamin的积累量明显提高，其他化合物则呈现不同程度的下降。叶盘转化法获得的CtCHI1过表达烟草植株的上游基因NtC4H、Nt4C的表达量显著增加，NtPAL则轻微下降。花青素积累量在OVX-15中下降达65%，槲皮素在OVX-5 和OVX-15中下降达70%，山萘酚则增加了10%-20%。CtCHI1的过表达对烟草代谢物的积累起分流作用。在CtCHI1过表达转基因红花中，上游基因CtPAL3、CtC4H1和CtCHS1分别增加3.9、2.1和3.0倍，但下游基因CtF3H和CtDFR2则明显下降。黄酮代谢物HSYA、芦丁、山萘酚-3-O-芸香糖苷和二氢山萘酚的含量均明显提高。在CtACO3转基因红花植株中，CtCHS1、CtCHI1和CtDFR1的表达量明显升高，而上游基因CtPAL1、CtC4H1和Ct4CL1的表达量明显下降。多数黄酮类化合物呈现不同程度的提高，其中醌式查尔酮提高20%，黄芩素和芦丁提高100%。研究还发现，CtFAD2-10基因主要富集在红花的子房和花瓣中调控脂肪酸代谢。.总之，药油兼用红花的品质主要受富集于子房和花瓣的脂肪酸合成途径基因FAD2-10对红花油的定向调控以及黄酮生物合成途径功能基因对其药用活性成分的直接调控，通过调控关键基因CHS1和CHI1可以显著提高红花中醌式查耳酮和黄酮醇苷的含量。此外，旁支通路的CtACO3可以和昼夜节律钟中心振荡器PRR相关基因相互作用，影响黄酮合成途径基因，进而间接调控黄酮类成分的积累。本结果为阐明药油兼用红花品质形成的分子机制提供了重要依据。.本成果发表论文11篇，其中SCI收录6篇，申请国家发明专利2项，获上海市科技进步奖二等奖1项。