kank1在鼻咽癌中失活机制与功能研究

经全基因组扫描和比较基因组杂交发现，kank1基因位于鼻咽癌LOH的热点区域9p24.3.本立项将通过Real-time RT-PCR和Western-blot筛查kank1在人鼻咽癌组织中表达情况，结合LOH和MSP方法检测相应DNA拷贝数及启动子区甲基化的异常，分析kank1基因在鼻咽癌中表达下调/缺失的机制。建立稳定表达kank1的鼻咽癌细胞系、表达下调的NP69细胞和裸鼠移植瘤模型，分析kank1表达改变后细胞系生物学特征、裸鼠成瘤性和EMT标志物的改变，阐明kank1基因的抑瘤功能。再以建立的细胞系为样本，分析kank1表达下调/缺失是否通过上调PI3K和Wnt-β-catenin信号通路活性而导致NPC的侵袭转移。本项目不仅有助于阐明kank1基因抑瘤作用的分子机理，而且能为鼻咽癌的发病与防治提供新思路，具有重要的理论和实际意义。

鼻咽癌是具有显著地域分布差异特性的与遗传、EB病毒感染和环境因素有关的一种上皮源性恶性肿瘤。遗传因素特别是瘤基因的激活和抑瘤基因的失活在鼻咽癌发病中具有十分重要的作用。kank1基因位于鼻咽癌染色体高频率缺失区域9p24.3。提示kank1与鼻咽癌可能相关。本项目检测kank1在鼻咽癌细胞系和组织中的表达情况。结果显示，kank1转录本在正常鼻咽细胞系NP69和几乎全部非癌组织均有表达，而在4株鼻咽癌细胞系和大于50%的鼻咽癌组织中表达下调或缺失。kank1蛋白在60%（12/20）的鼻咽癌组织中表达下调。结果表明，鼻咽癌中kank1基因存在高频率的表达下调/缺失。.采用PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染方法，分析kank1基因上下游的D9S1858和WI-12779二个微卫星位点在鼻咽癌组织中的杂合性缺失情况。结果显示，该位点发生LOH的频率分别为31.4%(11/35)和34.3%(12/35)，kank1基因LOH的频率为51.4%(18/35)；鼻咽癌细胞株和鼻咽癌组织中kank1基因全部出现甲基化位点，而正常组织中甲基化频率为60%（6/10）。提示kank1等位基因LOH和启动子高甲基化可能是导致其在鼻咽癌中表达下调/缺失的重要原因。采用不同浓度的去甲基化药物处理细胞，能部分恢复kank1 的表达并继续影响细胞的生长和凋亡。.采用脂质体转染技术建立kank1高表达的5-8F鼻咽癌细胞系。MTT分析结果显示，转染组细胞的增殖速度明显低于对照组；软琼脂集落形成实验的结果显示转染组细胞的克隆形成率低于对照组；流式细胞术分析的结果显示，转染组细胞Go/G1期细胞比例明显增加，S期和G2/M期细胞比例明显减少；流式细胞术和Hoechst 33258染色结果显示，转染组细胞的凋亡明显高于对照组细胞；细胞体外迁移和侵袭实验显示，转染组细胞的运动能力和侵袭能力均明显降低。研究结果提示，kank1具有抑制鼻咽癌细胞增殖、促进鼻咽癌细胞凋亡以及抑制鼻咽癌细胞体外迁移和侵袭的作用。.采用免疫组化（IHC）染色检测kank1在组织中的表达。结果显示，kank1在72.5%(50/69)的鼻咽癌组织中表达下调，而在14例正常鼻咽粘膜上皮中只有1例表达下调。kank1表达下调/缺失与鼻咽癌淋巴结转移和临床分期负相关。