介导阪崎肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的cPLA2α上游信号分子的研究

It is known that the pathogensis of neonatal meningitis caused by C. sakazakii results from hematogenous spread. However, how the C. sakazakii penetrates the blood brain barrier,mainly formed by brain microvascular endothelial cells(BMEC),is unclear. We previously shown that the activation of cPLA2α is required for C. sakazakii invasion into HBMEC.The project based on existing work is focused on the upstream signal molecules of cPLA2α activation. We elucidate that the interaction of signal molecule and cPLA2α in HBMEC to facilitate the C. sakazakii invaion of HBMEC and futher analyze the link between the signaling molecules and PI3K/Akt signaling pathway. Next in view of bacteria-host cell interactions, we will indentify the receptor protein on the surface of HBMEC that activates cPLA2α and in vitro and in vivo quantify the receptor function in C. sakazakii invasion of HBMEC and penetration of blood-brain barrier. The completion of this project will accumulate molecular mechanisms of the C. sakazakii invasion of HBMEC and crossing the blood-brain barrier. It is expected to provide a new strategies to prevent occurrence for C. sakazakii-induced meningitis.

致病菌阪崎肠杆菌（C. sakazakii）通过血液播散入脑引发新生儿脑膜炎，但它如何穿过以脑微血管细胞（BMEC）为主要组成成分的血脑屏障进入脑内，迄今尚不清楚。我们之前的研究显示：cPLA2α参与C. sakazakii 侵袭进入HBMEC的过程。本项目拟在现有工作基础上，鉴定HBMEC中cPLA2α上游使其活化的信号分子，阐明信号分子/cPLA2α相互作用"协助"C. sakazakii侵袭进入HBMEC的作用机制，进一步分析信号分子与PI3K/Akt信号通路之间的联系。然后从细菌-宿主细胞相互作用出发，筛选HBMEC表面能够活化cPLA2α的细菌的受体蛋白，体内和体外分析受体蛋白在C. sakazakii侵袭进入HBMEC，穿过血脑屏障中的作用；本项目的完成将推进对阪崎肠杆菌穿过血脑屏障分子机制的认识，可望为阪崎肠杆菌性脑膜炎的发生提供新的防治策略。

负责人的前期研究显示，cPLA2α参与C. sakazakii 侵袭进入人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的过程。本项目拟鉴定HBMEC 中cPLA2α上游使其活化的信号分子，同时筛选HBMEC 表面能够活化cPLA2α的细菌的受体蛋白，分析受体蛋白在C. sakazakii 侵袭进入HBMEC，穿过血脑屏障中的作用。本项目的完成可望为阪崎肠杆菌性脑膜炎的发生提供新的防治策略。主要研究进展：（1） 发现了 ERK分子可以活化cPLA2α在C. sakazakii侵袭HBMEC过程中。ERK抑制剂与cPLA2α抑制剂单独或联合使用预处理体外培养的HBMEC后，加入C. sakazakii进行细菌侵袭实验，结果显示，与单独使用ERK抑制剂与cPLA2α抑制剂相比，联合使用这两种抑制剂并没有显著降低C. sakazakii对HBMEC侵袭力；ERK抑制剂能明显阻断cPLA2α发生磷酸化，但不影响Akt的磷酸化改变。以上结果说明ERK和Akt作为cPLA2α活化的上游信号分子分别影响cPLA2α的活性参与C. sakazakii侵袭HBMEC的过程。（2）发现了VEGFR2参与C. sakazakii侵袭HBMEC激活cPLA2α分子的过程。VEGFR2特异性抑制剂能显著降低C. Sakazakii对HBMEC的侵袭力；干扰HBMEC中VEGFR2的表达也能降低C. Sakazakii侵袭进入细胞的数量。VEGFR2抑制剂和VEGFR2的siRNA都可以抑制C. Sakazakii引起的HBMEC中cPLA2α分子的活化，进而阻断细胞内细胞骨架的重排，减少细菌侵袭进入细胞的数量。（3）VEGFR2的抑制剂可以降低C. sakazakii 引起的细菌性脑膜的发病率。VEGFR2抑制剂能够减少C. Sakazakii感染小鼠脑脊液中细菌数量，同时VEGFR2抑制剂也能够恢复C. Sakazakii感染后引起的脑脊液中葡萄糖含量的降低。此外，VEGFR2抑制剂也能延长新生鼠感染C. sakazakii后的存活时间。（4）相关的探索性研究发现:（a）C. Sakazakii能够侵袭进入体外培养的神经元，并且cPLA2α抑制剂显著降低C. Sakazakii也侵袭进入神经元的数量；（b）Cystatin C蛋白通过激活SIRT1/ADAM10信号通路进而促进HBMEC中产生sAppα。