阪崎肠杆菌耐酸机理研究

As an important foodborne pathogen, Enterobacter sakazakii, which can cause a life-threatening form of meningitis and necrotizing colitis in neonates and children, has been attached great importance to the government and society. E.sakazakii with food enters the body eventually lead to disease process, need to resist the stomach's acid environment, this is one of the key factors of the pathogenic. Nowadays the study of E.sakazakii in the acid condition growth just stay in some phenotype, the molecular mechanism has not been reported. The project will conduct a systematic study of the growth of E. sakazakii in the acid environment and built the random mutant library of Enterobacter using transposon. Based on mutant of acid-resistant phenotype, genes associated with growth under acidic conditions will be located. Genes of Enterobacter, which upregulated under acidic conditions, will be found by proteomic analysis and knockout from Enterobacter. The function of these genes will be confirmed by back mutation in mutants. The levels of mRNA differential expression under acidic condition will be analyzed using fluorescence quantitative methods.The regulation mechanism of E. sakazakii in acid resistant will be proposed.

作为一种重要的食源性致病菌，阪崎肠杆菌因能引起新生婴幼儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎而受到了政府和社会的高度重视。在阪崎肠杆菌随着食物进入人体最终导致疾病的过程中，需要抵抗胃中的酸环境才能生存，这是其致病的关键因素之一。现今对它在酸环境下生长的研究分散、不系统，只是停留于某些表型，对其内在机制未见报道。本项目从耐酸的相关表型出发，利用转座子标签法构建阪崎肠杆菌随机突变体库并筛选耐酸性变化较大的突变体，对酸性条件下生长的相关基因进行定位。同时以细菌的蛋白质组为研究对象利用生物信息学从蛋白质组分析得到阪崎肠杆菌酸性条件下表达上调的相关基因，敲除这些相关基因得到突变体。对上述两种途径得到的突变体进行突变基因的回复表达确证基因功能，利用荧光定量mRNA差异表达方法分析酸性条件下相关基因转录水平的差异，提出阪崎肠杆菌的酸应激性调控机制。

阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii（现名克罗诺杆菌Cronobacter）是一种能引起新生婴幼儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎、败血症等疾病的重要食源性致病菌，而阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii）是克罗诺杆菌属的模式菌种，阪崎克罗诺杆菌在经过胃酸屏障并存活时所拥有的酸耐受性是其致病的关键因素之一。本项目首先在前期全国奶粉中克罗诺杆菌污染调查的基础上开展了该菌在全国即食食品和蔬菜中的污染调查研究，共分离得到282株克罗诺杆菌，阪崎克罗诺杆菌为蔬菜和即食食品中的优势菌种。其中，即食食品和蔬菜中克罗诺杆菌污染率分别为18.6%（52/280）和30.27%（122/403），即食食品中阪崎克罗诺杆菌O2和ST8分别为其优势血清型和序列型别， 蔬菜中阪崎克罗诺杆菌 O1和ST64分别为其优势血清型和序列型别。然后基于污染调查研究所获得的菌株，我们从耐酸表型出发筛选出强耐酸分离株C. sakazakii 1409C1作为研究对象，开展阪崎克罗诺杆菌在酸胁迫环境下的比较转录组和蛋白组分析，从组学水平揭示酸胁迫下基因转录、调控规律其蛋白动态变化规律。根据转录组和蛋白组的数据，我们发现转录组和蛋白组的结果保持很好的一致性；当阪崎克罗诺杆菌暴露在酸胁迫环境中，菌体的鞭毛合成、氨基酸合成与代谢、脂肪酸代谢及基于NAD(P)H介导的质子消耗等生理活动在其耐酸过程扮演着重要的角色。此外，grxB基因有助于阪崎克罗诺杆菌在酸胁迫下的生存，并且此基因在该菌的表面疏水性、自凝力能力和生物膜的形成过程起到正调控作用。引起这种现象的原因可能是因为在谷胱甘肽代谢过程中，谷氧还蛋白作用结合NADPH/NADP降低胞质二硫化物的反应有助于质子的消耗，从而提高菌体抗酸性。本项目研究充实了阪崎克罗诺杆菌的转录组和蛋白质组数据库，初步阐明了其酸耐受性机制，为及时有效地预防和控制由阪崎克罗诺杆菌造成的食源性危害提供理论基础。