FoxM1癌性转录因子调控AFP转录致再活化的分子机制研究

肝脏AFP基因在HCC发生过程中再活化的分子机制一直是未解之谜，其中转录激活因子对AFP启动子的调控可能是AFP再活化的重要机制。在执行前NSFC项目中实验新发现：与HCC发生密切相关的癌性转录因子FoxM1在肝组织的时空表达模式与AFP完全一致，HCC癌组织中FoxM1表达强度与血清AFP水平密切相关，特异性抑制FoxM1表达后，HCC细胞AFP分泌水平显著下降；生物信息学分析显示AFP启动子含有与FoxM1结合的顺式作用元件；CHIP实验初步证实人AFP启动子上存在FoxM1结合位点。推测：FoxM1极有可能直接调控AFP转录致AFP再活化。本项目拟采用荧光素酶活性分析、EMSA、DNA pull-down和CHIP等方法从体内、外证实FoxM1可直接与AFP启动子相结合，并鉴定出相应的顺式调控序列，揭示AFP在HCC发生过程中再活化的分子机制，为临床HCC分子靶向治疗提供新靶点。

目的：研究人肝细胞肝癌（HCC）中转录因子FOXM1表达的临床意义及其调控AFP表达与分泌的分子机制。方法： （1）采用Western blot技术检测52例HCC患者肝癌组织中FOXM1蛋白的表达，并分析其与HCC患者临床病理特征的关系；（2）采用荧光定量PCR技术检测HCC患者肝癌组织中AFP mRNA表达水平，电化学发光法检测患者术前血清AFP分泌水平，通过Pearson相关性分析方法分析HCC患者癌组织中FOXM1蛋白表达水平和AFP mRNA表达水平及术前血清AFP分泌水平三者的相关性；（3）最佳MOI的重组FOXM1腺病毒分别感染AFP高表达的HepG2、HepG2.2.15细胞和AFP低表达的SMMC7721细胞，感染24 h后通过荧光定量PCR技术验证细胞内FOXM1 mRNA表达情况，感染48 h后通过Western blot技术验证细胞内FOXM1蛋白表达情况及其下游基因cyclinB1蛋白表达变化情况；（4）以最佳MOI的重组FOXM1腺病毒感染HepG2、HepG2.2.15和SMMC7721细胞，感染24 h后通过荧光定量PCR检测FOXM1蛋白对AFP mRNA表达的影响，感染48 h通过Western blot和电化学发光法观察FOXM1蛋白对AFP蛋白的表达及分泌的影响。（5）CHIP实验检测AFP启动子上能够与FOXM1相结合的顺式作用原件。结果：（1）FOXM1表达与HCC肿瘤大小和淋巴转移有关（P1=0.039，P2=0.039），与年龄、性别、肝硬化、HBV感染状态和肿瘤分期无关。（2）HCC患者肝癌组织中FOXM1蛋白表达水平与AFP mRNA表达水平及术前血清AFP分泌水平均呈正相关（r=0.448，P=0.001；r=0.381，P=0.005）。 （3）HepG2和HepG2.2.15细胞中FOXM1可显著促进AFP mRNA和蛋白的表达及AFP的分泌；SMMC7721细胞中FOXM1仅可促进AFP mRNA的表达，但不能促进AFP蛋白的表达和分泌。 （4）CHIP实验证实FOXM1能与AFP启动子上的8个Forkhead 反应元件(FHREs) 相结合。 结论：（1）人肝细胞肝癌中FOXM1表达与肿瘤大小和淋巴转移有关，FOXM1在HCC肿瘤发展和转移过程中可能发挥重要作用；（2）人肝细胞肝癌中FOXM1表达与AFP