凡纳滨对虾Nrf2-Keap1通路抗氧化应激机制及其对抗病能力影响的研究

Shrimp is the main aquaculture species in China. As breeding environment deterioration, shrimp disease getting more and more serious, and restricted the development of this industry. The reactive oxygen species (ROS) produced by oxidative stress are involved in the shrimp immune response under specific circumstances. And the negative effect of excessive ROS on shrimp immune system is considered as an important cause of shrimp diseases. There are a number of studies show that environmental stresses result in shrimp cells ROS increasing, Nrf2-Keap1 pathway effectors genes inducing and disease resistance inhibition. However, the mechanism of oxidative-antioxidant system stability maintaining by Nrf2-Keap1 pathway, and the relationship between Nrf2-Keap1 pathway and ROS associated immune response still far from clear. This project intends to find out the response regularity of Nrf2-Keap1 pathway on oxidative stress, the mechanism of Nrf2-Keap1 pathway on Litopenaeus vannamei oxidation-antioxidation system maintaining, the influence of Nrf2-Keap1 pathway activity on L. vannamei antioxidant ability, the relationship between Nrf2-Keap1 pathway and L. vannamei disease resistance, to revealing the central role of Nrf2-Keap1 pathway in oxidative stress response, and to elucidating the mechanism of its effects on L.vannamei anti-pathogen capacity.

我国是凡纳滨对虾养殖大国，然而养殖环境恶化、病害严重，制约了该产业的健康发展。氧化应激所产生的活性氧（ROS）在特定情况下可参与对虾抗菌免疫，而过量ROS对其免疫系统功能的负面影响则被认为是对虾多种病害的重要诱因。在对虾中，有多个研究表明环境胁迫引起其细胞中ROS的上升，激活Nrf2-Keap1通路下游效应因子并影响到对虾的抗病功能。然而目前对于凡纳滨对虾中Nrf2-Keap1通路维持其氧化-抗氧化系统稳定的机制及其对凡纳滨对虾中ROS相关免疫反应的影响仍不清楚。本项目拟就Nrf2-Keap1通路对氧化应激的响应规律、其通路活性对凡纳滨对虾抗氧化应激能力的影响，Nrf2-Keap1通路对ROS相关免疫反应过程的调控作用及由此产生的对凡纳滨对虾抗病害能力的影响等若干方面开展研究，揭示Nrf2-Keap1通路维持凡纳滨对虾氧化-抗氧化系统平衡的分子机制，并阐明其影响凡纳滨对虾抗病能力的机理。

本项目就凡纳滨对虾Nrf2-Keap1通路对氧化应激的响应规律、其通路活性对凡纳滨对虾抗氧化应激能力的影响，Nrf2-Keap1通路对ROS相关免疫反应过程的调控作用及由此产生的对凡纳滨对虾抗病害能力的影响等若干方面开展研究，以阐明其影响凡纳滨对虾抗病能力的机理。项目总体完成情况良好，主要成果如下：.(1).揭示凡纳滨对虾Nrf2-Keap1通路的氧化应激响应功能.利用RNAi技术结合转录组学测序分析技术，全面地获得了凡纳滨对虾血淋巴细胞中氧化应激，尤其是Nrf2-Keap信号通路相关的基因信息，从而厘清凡纳滨对虾 Nrf2-Keap1通路基本组成；建立基因LvNrf2亚细胞定位及靶基因的real-time RT-PCR检测的凡纳滨对虾 Nrf2-Keap1通路活性检测方法；掌握了凡纳滨对虾Nrf2-Keap1通路对在β-葡聚糖注射情况下造成的慢性氧化应激及H2O2注射情况下造成的急性氧化应激的响应规律。.(2).发现凡纳滨对虾Nrf2-Keap1通路活性与其抗应激能力的关系.通过LvNrf2敲降、LvKeap1或人工氧化应激的方法改变凡纳滨对虾 Nrf2-Keap1 通路活性，分析其对凡纳滨对虾血淋巴细胞中 ROS 浓度的及氧化应激能力的影响；改变凡纳滨对虾 Nrf2-Keap1 通路活性对免疫、内置网应激及细胞凋亡等氧化应激相关通路的影响。.(3).揭示凡纳滨对虾 Nrf2-Keap1 通路对 ROS 相关免疫反应的调控.通过对凡纳滨对虾金属基质蛋白酶 (LvMMP2) 及活性氧物种调节因子1 (LvRomo1) 的研究，从分子水平检测凡纳滨对虾 Nrf2-Keap1 通路对 “呼吸爆发” 等与酚氧化酶原级联系统相关的细胞免疫过程的影响；通过对抗菌肽基因LvCrustin及漆酶 (LvLac1) 等基因的功能的研究，揭示凡纳滨对虾Nrf2-Keap1通路调控 ROS 相关免疫反应的机制。.(4).明确凡纳滨对虾 Nrf2-Keap1 通路对其抗病害能力的影响.阐明凡纳滨对虾Nrf2-Keap1通路活性对凡纳滨对虾体内 WSSV 增殖的影响及其机制；研究了凡纳滨对虾Nrf2-Keap1通路对其抗弧菌感染的影响；通过特异性通路抑制剂处理或 RNAi 干扰技术，研究若干受Nrf2-Keap1通路影响信信号通路在抗WSSV或弧菌感染中发挥的作用。