14-3-3蛋白对AD模型大鼠细胞周期的调控机制及艾灸的防治作用研究

细胞周期紊乱导致tau蛋白异常磷酸化、神经元纤维缠结是阿尔茨海默病病理机制的新假说。本课题拟在前期研究工作基础上，以脑室内注射Aβl-42诱导AD模型大鼠为对象，采用相关分子生物学技术，首次从14-3-3蛋白调控异常细胞周期的角度，探讨14-3-3蛋白与细胞周期相关因子之间的失调，对tau蛋白聚积与磷酸化的影响及其在学习记忆过程中的作用，为深入揭示针灸改善学习记忆功能的作用机制提供全新资料；进一步从治未病的角度探讨艾灸预处理对AD痴呆模型大鼠14-3-3蛋白调控异常细胞周期及其相关因子的影响；为临床有效防治学习记忆相关疾病提供一定理论与实验依据。

本研究以海马注射Aβ1－42建立AD模型，在“治未病”指导思想下，采取在AD造模前施灸3疗程，造模成功后再施灸的治疗方法。利用免疫印迹及激光共聚焦等相关分子生物学技术，从14-3-3蛋白调控异常细胞周期角度，探讨14-3-3蛋白与细胞周期相关因子之间的失调，对tau蛋白聚积与磷酸化的影响及其在学习记忆过程中的作用，为深入揭示针灸改善学习记忆功能的作用机制提供全新资料。 . 研究成果：1）预艾灸刺激在有效下调Cyclin A和CyclinB、CDK2和CDK5异常表达的基础上，又促进P27和p21抑制因子的表达，一方面抑制CDK激活,另一方面可抑制激活后的cyclin-CDK复合物活性,有效调节AD发生发展中Cyclins、CDKs和CKI间的作用失调，阻滞细胞周期的进程。2）细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2和CDK5的异常激活是导致tau蛋白异常磷酸化机制之一。预艾灸刺激在有效下调CDK2和CDK5的异常激活情况下，也抑制了tau蛋白的过度磷酸化，对AD病理的进程与发展起到了一定的抑制作用。3）14-3-3蛋白在预艾灸刺激降低因CDK2和CDK5异常激活而导致tau蛋白异常磷酸化的过程中具有关键作用。研究显示，模型组14-3-3蛋白表达较正常组明显增强，与tau蛋白表达一致。通过艾灸百会、肾俞后14-3-3蛋白的表达依然较强。激光共聚焦定位发现，模型组红色Tau蛋白荧光标记与绿色14-3-3蛋白荧光标记发生共定位而呈现为黄色；而预灸组Tau蛋白与14-3-3蛋白的共定位呈色以偏绿色为主。说明在AD发生发展中14-3-3蛋白作为海马趾NFT的关键成份，能与微管蛋白竞争结合Tau蛋白,而导致微管不稳定。但预艾灸增强14-3-3蛋白的表达，并没有进一步结合Tau蛋白而恶化微管的不稳定。其机制可能是一方面通过结合磷酸化CDC25（CDC25家族蛋白可以去磷酸化而激活CDK2）的一些位点，使CDC25被滞留在胞质中，远离自己的作用底物CDK/Cyclins，使CDC25磷酸酶对G1/S期和G2/M期转换的调节作用失活，导致细胞周期阻滞；另一方面直接与P27/cip抑制因子相互作用而调控细胞周期，减少与Tau蛋白结合机会，从而抑制tau蛋白对神经元的损伤作用。. 其他成果：在项目资助下发表论著6篇，参加学术会议4人次，主题报告交流1次；1篇优秀论文奖；培养5名硕士