脉络膜新生血管疾病中HTRA1基因的表观遗传学机制

HTRA1 is one of the major genes related to choroidal neovascularization (CNV), and epigenetic regulation plays an important role in its expression. Nevertheless, such regulation mechanism has not been reported in AMD studies. Our preliminary results show that hypomethylation are probably associated with CNV. Therefore, we hypothesize that epigenetics of HTRA1 is involved in CNV. The mechanism might be, HTRA1 hypomethylaiton by DNA methyltransferase, affecting gene expression and eventually leads to CNV. To test this hypothesis, the current proposal attempts to perform HTRA1 promoter methylation assay and genome-wide DNA methylation level and profiling by fluorescent polarization and reduced representation bisulfite sequencing, in order to evaluate the role of epigenetics in CNV. Luciferase reporter plasmids containing methylated HTRA1 promoter will be expressed in vitro in choroidal endothelial cell lines. The effects of methylation on gene expression and related cellular and environmental factors will be assessed. Animal models such as transgenic mice overexpressing Htra1 will be used to study the effects of HTRA1 promoter hypomethylation, and perform gene network analysis using both RNA-seq and system biology approaches. The expect results will unveil the relationship between HTRA1 epigenetic regulation, early events and etiology of CNV disorders.

高温要求蛋白A丝氨酸肽酶1（HTRA1）是脉络膜新生血管疾病（CNV）的主要相关基因之一，表观遗传调控在其表达过程中起重要作用，但在CNV中尚未见报导。我们的前期研究表明，CNV很可能伴有HTRA1的低甲基化。据此我们提出假说，HTRA1的表观遗传与CNV相关，其机制可能是DNA甲基转移酶使HTRA1启动子低甲基化，影响表达调控，导致CNV。为验证假说，我们拟检测HTRA1和基因组的甲基化，利用高通量测序寻找相关甲基化位点，评估其与疾病的相关性以及对表达的影响；在恒河猴脉络膜内皮和人的视网膜色素上皮细胞系中表达带HTRA1启动子的荧光素酶，探讨表达调控机理，分析细胞内因子和环境因素对DNA甲基化的影响；以HTRA1转基因小鼠等为动物模型，结合转录组测序和系统生物学，研究体内脉络膜组织中HTRA1信号调控的基因网络。通过本研究，期望能明确HTRA1在CNV中的表观遗传机制，探索新的治疗策略。

高温要求蛋白 A 丝氨酸肽酶 1(HTRA1)是脉络膜新生血管疾病(CNV)的主要 相关基因之一，表观遗传调控在其表达过程中起重要作用，但在 CNV 中尚未见明确报导。在本研究中我们从CNV患者临床样本、体内和体外等多个层面，利用多组学等技术手段对HTRA1 的表观遗传改变及其在 CNV 的作用和机制深入的探讨和研究。本项目在前期国家自然科学基金所资助工作的基础上，进一步收集对照、湿性AMD 和PCV 患者的详细临床数据和血样，丰富和完善了相关CNV疾病的样本库；对HTRA1的遗传多态性进行了分析，验证了其与AMD发病风险的关联；我们的研究结果首次发现HTRA1的遗传多态性与AMD以及PCV病人中包括病灶位置和诊断年龄等内表型的存在显著的相关性；利用Bisulfite测序以及甲基化DNA免疫共沉淀（MEDIP）测序和全转录组测序等多种技术对湿性AMD患者外周血白细胞进行研究，首次证明AMD患者HTRA1 启动子的甲基化模式及基因组范围内DNA甲基化存在显著改变，并存在明显的低甲基化情况，同时发现了与AMD有关的多个lncRNA和miRNA；获得了激光诱导CNV小鼠脉络膜中Htra1表达的动态数据，证明其参与了CNV的发生过程；利用MEDIP测序，首次发现体内条件下激光诱导CNV小鼠的视网膜DNA中包括Htra1在内的基因发生明显的低甲基化；取得激光诱导CNV小鼠视网膜的lncRNA-Seq和小RNA的数据和表达谱，发现lncRNA和miRNA等非编码RNA参与CNV表观遗传调控的重要证据，建立了CNV差异表达基因的互作网络，揭示了其与炎症及补充通路的重要关系。 根据项目的部分数据，已经撰写了5篇以上论文，已发表的有3篇SCI期刊，其中包括JCR大类一区1篇，小类1类一区1篇，累计影响因子超过13，在6次以上国内外学术会议进行过报告并获得4次省级人才头衔，培养研究生3名。通过本项目的研究，为理解HTRA1及其相关表观遗传学在CNV的发生以及AMD及PCV等疾病的发病过程中可能起的重要作用提供了数据和重要依据，也为进一步开发Htra1启动子区甲基化及相关表观遗传改变作为生物标识物和相关通路作为临床治疗新的途径和靶点提供了重要的参考。