Fonsecaea monophora黑素对Dectin-1、Mincle受体的功能调控及其机制研究

F. monophora is the etiologic agent of chromoblastomycosis in southern China. Dectin-1 and mincle are the major receptor involved in host immune response. Our previously studies showed that melanin triggerd the Th2, while inhibit Th1 response. However, whether melanin was involved in regulation of Dectin-1 and mincle receptors are still remained unknown. In the present study, we aim to construct the pks deficient strain and recovery strain, and compare the differences of the host immune response, including Dectin-1, mincle and downstream singal moleculars, when treated with wild type, dificient, recovery and albino strains. In vivo, we will compare the immune response of wistar rats among the different groups. The study will clarify the the role of melanin in modulating host immune response to F. monophora and therefore provide a basis in understanding the pathogenesis of chromoblastomycosis and searching new targets of antifungal agent.

F. monophora是我国南方着色真菌病（CMB）的主要病原体。研究表明，模式识别受体Dectin-1及mincle在CMB机体免疫激活过程中起重要作用。我们前期研究发现， F. monophora黑素能够抑制TH1细胞因子的产生，促进TH2细胞因子产生; 但黑素是否能够通过调控Dectin-1、mincle参与免疫调节尚有待证实。本研究拟构建F. monophora 多聚酮合酶（pks）基因敲除株和回复株，比较野生株、敲除株、回复株及白化株在体外对Dectin-1、mincle受体及下游信号分子的影响；体内对宿主免疫应答的差异，旨在阐明F. monophora黑素通过屏蔽菌体抗原成分，干扰Dectin-1、mincle受体与病原体的相互识别，弱化固有免疫的分子机制，为进一步揭示着色真菌病的发病机制并寻找可能的抗真菌药物新靶位提供理论依据。

着色真菌病(Chromoblastomycosis)，是一种慢性进行性皮肤和皮下组织肉芽肿性真菌病，F. monophora 是我国南方地区着色真菌病的主要致病菌,DHN-黑素是着色霉菌属的重要特征,也是重要的毒力因子。为了阐明F. monophora黑素在免疫识别中的重要作用，我们做了如下研究。成功构建了 Fonsecaea monophora PKS/色素敲除株，证实Fonsecaea monophora的PKS基因被敲除后，其生长明显变慢，通过棉兰染色和扫面电镜的方法比较了PKS基因对Fonsecaea monophora产孢量的影响，结果发现，PKS基因被敲除后，其产孢量明显降低。野生型Fonsecaea monophora可以在酸性（ph=3）PDA环境中生长，而PKS敲除后Fonsecaea monophora在酸性环境中却几乎无法生长。体外研究F. monophora 标准株、色素株与白化株对巨噬细胞模式识别受体TLRs及其下游通路分子的影响，建立小鼠巨噬细胞（J774A.1）与F.monophora体外共培养模型，提取共培养体系中的巨噬细胞RNA，进行高通量测序，对所有样品的KEGG富集通路提取并集，并且根据样品在该通路的富集程度q值做出分布图，结果提示色素组与白化组有统计学意义的差异基因主要富集在以下四条通路：Cytokine-cytokine receptor interaction、TNF signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway和MAPK signaling pathway，相应的代谢通路。由此我们筛选得到与本课题相关的具体基因有：Tnf、Traf1、Tnfaip3、Tnfrsf1b、Jun、Fos、Mapk13、Cebpb、Ptgs2、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl10、Ccl2、Ccl3、Ccl4、Cd86、Il1a、Il1b、Il6等等。qPCR验证样本中上述基因表达量与测序结果一致。体内研究F.monophora色素菌株与白化菌株侵袭皮肤组织的致病性差异，予色素株、白化株感染BALB/c小鼠足垫，色素株组的炎症反应高峰期在感染后第15天，发生较迟；白化株组的炎症反应高峰期在感染后第10天，色素株组小鼠的足垫炎症反应程度明显强于白化株组，其红肿、化脓、渗出更严重，感染