Monophora着色霉黑素抵抗宿主中性粒细胞杀伤的作用机制研究

As an important virulence factor, melanin of F. monophora can resist to the killing of host immune cells. Recruitment of neutrophil might play an important role in preventing proliferation and spread of F. monophora, however， the molecular mechanism of how F. monophora resist to neutrophils remains unclear. Based on our previous research, we speculated that F. monophora melanin might directly influence the killing ability of neutrophils. In this study, we will establish the co-culture of melanin, albino and melanin recover strains with human neutrophil and the mouse model for clarifing the effect of F. monophora melanin influence on the neutrophils, which through resisting active oxygen and granzyme , and reducing the production of ROS by inhibiting NADPH oxidase to affect the formation of NETs to escape the damage effect of neutrophils.

黑素是F. monophora抵抗宿主免疫细胞杀伤的重要毒力因子，中性粒细胞在阻止F. monophora增殖并进一步播散的的局部免疫中可能起到更为重要的作用，但对于F. monophora如何逃避中性粒细胞杀伤的分子机制尚未清楚。根据文献及前期研究基础我们推测F. monophora黑素可能直接影响中性粒细胞的杀伤功能。本课题将通过建立黑素株、白化株及色素回复株与人中性粒细胞共培养体系及小鼠动物模型明确F. monophora黑素不仅通过抵抗活性氧及颗粒酶的杀伤，而且通过抑制NADPH氧化酶，减少ROS的产生从而影响中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成来抵抗中性粒细胞杀伤作用的分子机制。

F. monophora是我国南方着色芽生菌病的主要病原菌。此研究主要探讨黑素如何影响宿主对F. monophora的免疫杀伤及探讨宿主中性粒细胞杀伤病原菌的作用机制。主要研究内容包括：1）分析着色芽生菌病广东地区流行病学特征及患者皮损中性粒细胞及NETs的表达情况；2）构建F. monophora 黑素 pks1基因敲除株（△pks1）及回补株（△pks1pks1+），分析黑素缺失及回补后菌株对各种环境因素的抵抗力及其毒力；3）构建F. monophora标准株、△pks1、△pks1pks1+足垫感染模型，比较不同菌株的体内毒力差异；4）：构建健康人外周血中性粒细胞与F. monophora共培养模型，分析黑素抵御中性粒细胞吞噬杀伤F. monophora孢子的作用及不同形态菌株诱导NETs的形成情况；5）构建清除中性粒细胞Balb/c小鼠足垫感染F. monophora模型，明确中性粒细胞在F. monophora 足垫感染中的作用 .结果发现：结果发现：1）疣状皮损是CBM最常见的皮损类型，F. monophora是广东地区的主要致病菌，中性粒细胞为CBM患者组织主要组成成分，硬壳小体被发现存在于中性粒细胞微脓疡中，并且伴有NETs的产生。采用同源重组法成功构建pks1基因敲除株（△pks1）及回补株（△pks1pks1+），发现标准株及回补株抵抗各种应激压力能力明显强于△pks1，通过构建小鼠感染模型发现标准株及回补株毒力明显强于△pks1，且更能引起中性粒细胞向感染部位的聚集。体外实验构建人源中性粒细胞与F. monophora菌株共培养模型发现中性粒细胞对△pks1孢子有更强的吞噬及杀伤作用，F. monophora 孢子未能诱导NETs的形成，F. monophora 短菌丝及硬壳小体可诱导NETs的形成，提示短菌丝和硬壳小体具有更强的毒力。并成功构建了清除中性粒细胞Balb/c小鼠足垫感染F. monophora模型，发现中性粒细胞在杀伤F. monohopra的过程中发挥着重要的作用，可通过抑制F. monophora出芽，影响组织细胞因子的表达等发挥作用。本研究证实了中性粒细胞在杀伤F. monohopra 发挥着重要作用，黑素为F. monophora一重要的毒力因子，能够有效影响宿主的免疫杀伤。该研究对揭示着色芽生菌病的病原菌的致病机制及中