科罗索酸的生物催化合成及其基因工程菌的构建

Corosolic acid, a natural product, has a very broad market prospects because of the significant effect of prevention and treatment of diabetes and obesity. At present, there are two main methods, extraction from the plants and chemical synthesis, to preparation corosolic acid. Corosolic acid in plant is very low while the chemical synthesis has disadvantages of tedious steps and more by-products. Therefore, to explore a new method with high efficiency and economy to prepare corosolic acid has become a key scientific problem to be solved. Based on our previous research, it was found that natrual product ursolic acid can be biocatalyzed into corosolic acid through directly asymmetric hydroxylation by microbial whole cells. The key point of this project is to screen and isolate the oxygenase-producing strains with high selectivity and enantioselectivity by multi-step enriching culture method, and the soil and endophytes from plants will be collected from southwest of china with abundant natural resources. Moreover, the library of monooxygenases producing strains with high activity and selectivity will be applied to biosynthesis of corosolic acid and the one-step biocatalysis directly of corosolic acid will be achieved by precursors. Oxygenase-producing strains to biosynthetise corosolic acid will be improved by high-throughput sequencing and gene engineering technology and the efficient gene engineering bacteria will be constructed. This project will explore new methods for preparation of corosolic acid and has an important guiding meaning for the green production of corosolic acid.

科罗索酸是一种天然产物，因在防治糖尿病和肥胖症方面疗效显著而具有非常广阔的市场前景。目前科罗索酸的制备方法主要通过植物提取和化学合成两种方式，但其在植物中的含量很低。而化学合成则步骤繁琐，副产物多。因此，探索科罗索酸的高效、经济的合成方法是一个凾待解决的关键科学问题。据前期研究发现，微生物整细胞能将天然产物乌苏酸通过定点的不对称羟基化反应，生物催化合成科罗索酸。本项目的研究重点是从自然资源丰富的西南地区选取独特的土壤和植物内生菌样本，采用多次富集培养和分离，筛选和发现具有高活性、高选择性的氧化酶菌株库，并应用到科罗索酸的生物合成反应，实现通过生物转化反应由前体底物直接一步合成科罗索酸，并进一步利用高通量测序技术和基因工程手段，改造和进化生物合成科罗索酸的氧化酶菌株，构建高效的基因工程菌并用于科罗索酸的转化合成中。本项目将探索科罗索酸的新型制备方法，对科罗索酸的绿色化生产具有重要的指导意义。

科罗索酸是一种天然产物，因在防治糖尿病和肥胖症方面疗效显著而具有非常广阔的市场前景。目前科罗索酸的制备方法主要通过植物提取和化学合成两种方式，但其在植物中的含量很低。而化学合成则步骤繁琐，副产物多。因此，探索科罗索酸的高效、经济的合成方法是一个凾待解决的关键科学问题。本项目从不同生境、不同地区分离微生物菌株80余株，构建包括细菌和真菌，包括常温菌和低温菌在内菌株库，用于筛选能够催化合成科罗索酸的活性菌株。结果显示Streptomyces griseus subsp. griseus CGMCC 4.18能够通过一步羟基化反应由熊果酸生成科罗索酸。项目对阳性反应从培养基组成、转化时间、底物浓度、反应pH等方面进行条件优化，课题组考察了100 mL三角瓶内装40 mL GYM培养基的转化条件优化，通过HPLC-MS检测转化产物的量。结果表明，菌株在GYM培养基可以实现转化，而在PDA培养基无催化活性。当转化时间第五天，底物浓度125 μg/mL，pH = 9 以及 10% 的接菌量时，目标产物科罗索酸的量都达到最大。此外，本项目还利用建立的菌株库筛选了其他三种天然产物，土壤微生物T003可以催化氧化槐定碱还原成槐定碱，而植物内生菌03-L-93却能把槐定碱催化合成氧化槐定碱。项目还对目标产物科罗索酸进行结构修饰研究, 通过内生真菌02-L-37的生物催化, 得到一个结构新颖的衍生物, 2α,3β,7β-三羟基-乌苏-11-烯-28,13-内酯。基因组序列测定显示菌株S. griseus subsp. griseus CGMCC 4.18基因组共8.47Mb，G+C含量72.3%。通过对序列的分析，本项目通过三对引物成功克隆到目的基因（约1350bp），通过EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切已经连接到载体pET28（a），PCR验证、序列测定与目的基因大小一致，后续的实验还在继续进行中。本项目共发表SCI论文3篇，省级期刊3篇。项目组1人晋升高级职称，1人晋升中级职称。 正在培养硕士研究3名，本科生4名。本项目将探索科罗索酸的新型制备方法，对科罗索酸的绿色化生产具有重要的指导意义。