闭合环形探针的制备及其在miRNA高效检测中的应用研究

MicroRNAs (miRNAs) are crucial regulators of gene expression. The abnormal expression of miRNAs may contribute to serious diseases, such as cancers, cardiovascular disease, and neurological disorders. It is challenging to discriminate similar miRNA sequences, since miRNAs within a family can differ by a single base mismatch. Herein, we try to develop a novel ring probe for miRNA detection and imaging with high selectivity and signal/noise ratio. Copper free click reaction will be employed to link the two ends of the linear DNA strand. The big tension force of the ring structure could greatly increase the sequence recognition specificity. Toehold initiated strand displacement further amplify the specificity while reducing the background, which ensures the efficient miRNA determination in live cells. In addition, DNAzyme based signal amplification will be exploited to increase the sensitivity of the probe. We believe that this new probe would find wide application in profiling of endogenous miRNA and be potential candidate method for helping us diagnosing miRNA related diseases.

MicroRNA (miRNA) 是一类内源性的非编码小分子RNA，广泛参与真核生物的生长发育、新陈代谢和应激反应等生命活动。研究表明miRNA的异常表达与多种疾病如癌症、心血管、神经紊乱性疾病等密切相关。因此，开发对miRNA有高选择性和高灵敏度的检测技术具有十分重要的意义。本项目拟发展一种基于分子信标的闭合环形探针，利用小环形探针所具有的杂交张力，从而实现对目标miRNA的高选择性识别。同时我们将结合DNAzyme的信号放大作用，进一步提高miRNA检测的灵敏度。此外，我们所设计的探针是通过目标分子的识别产生信号恢复，可以有效地降低检测背景，提高信噪比，从而实现活细胞内miRNA的成像与定量分析。本项目提供高灵敏和高选择性的miRNA检测技术，将有助于进一步理解miRNA与疾病发生发展的关系，为疾病的早期诊断及治疗提供新的思路。

MicroRNA (miRNA)的异常表达往往与多种疾病如癌症、心血管、神经紊乱性疾病等密切相关。对生物样本的miRNA 进行快速灵敏的检测一方面可以帮助很好的理解疾病的发病机理，另一方面有助于实现人类疾病的早期诊断。但鉴于miRNA 序列结构的相似性极高与种类繁多等固有特点，已报道的检测技术和表征方法在重现性和选择性上尚无法满足miRNA在临床诊断方面的应用需求，因此，发展一种更加简单、快捷、具有高选择性和高灵敏度的miRNA 检测方法具有十分重要的意义。为此，我们首先制备了环形探针，利用杂交张力和链置换，大大提高了室温下miRNA检测的选择性，并实现了活细胞内miRNA的原位成像。紧接着为进一步提高检测的灵敏度，我们在前面的工作的基础上，引入了具有自催化性能的DNAzyme以及共轭聚合物荧光共振能量转移的双重信号放大效应，在保证检测专一性的基础上，大大地提高了检测的灵敏度，实现了不同细胞样本内miRNA含量的检测，并且其检测结果与金标准定量聚合酶链反应（qRT-PCR）得到的结果是大体一致的，进而充分证实了我们所提出方法的准确性。为了推动检测方法用于临床样本检测的可能性，我们进一步改进了条件，优化了方法，在前面工作的基础上，引入了磁珠分离技术，并利用共轭聚合物与不同染料小分子间的有效的荧光共振能量转移，发展了多重miRNA检测技术，以适应多样本检测的需要。实验结果表明，经过优化和改进的检测方法，不仅能实现多种miRNA的同时检测，而且检测信号还可以根据特定的逻辑门以逻辑信号的输出，从而有望为推动与miRNA相关疾病的早期诊断与治疗提高新的思路与策略。