杜仲橡胶颗粒蛋白编码基因克隆及功能分析

Eucommia ulmoides Oliv. (E. ulmoides), the precious tonic herbs in traditional Chinese medicine, have great development prospect in rubber industry. However, the mechanism of the rubber biosynthesis in E.ulmoides remains unclear. The proposal is based on the transcriptome and genome database constructed from E.ulmoides and combine the previous research on proteomics of E. ulmoides rubber particles. The genes that encoded E. ulmoides rubber particle protein, EuRPP16 and EuSRPP1-4, will be identified and cloned. The target gene overexpressed or silenced transgenic E. ulmoides plant and callus will be generated via transgenic technology. Comparison of the rubber content, rubber molecular weight and the difference of pattern and composition between the target gene overexpression and silencing E. ulmoides plant or callus will indicate the function of the gene that encoded rubber particle protein. The research will offer the important basic documents on revealing the mechanisms of rubber particle formation and rubber biosynthesis in E. ulmoides. The study results will also provide theoretical evidence and gene candidates to the improvement of E. ulmoides by transgenic engineering.

杜仲是传统名贵中药材，亦是最具开发前景的胶原植物，但其橡胶合成机理尚未阐明。本项目以构建完成的杜仲基因组及转录组注释数据库为基础，结合前期杜仲橡胶颗粒蛋白组学研究结果，筛选并克隆杜仲橡胶颗粒蛋白编码基因EuRPP16和EuSRPP1~4，并利用转基因技术遗传转化杜仲，筛选目标基因超量表达和沉默的杜仲转基因植株和愈伤组织，分析比较转基因植株目标基因超量表达或缺失对植株或愈伤组织含胶量、橡胶分子量以及橡胶颗粒形态、组分的差异，明确杜仲胶颗粒蛋白编码基因的功能，为阐明杜仲胶颗粒形成和杜仲胶生物合成机理提供重要的基础资料，也为杜仲基因工程改良提供理论依据和目标基因。

杜仲是我国传统名贵中药材，亦是最具开发前景的胶源植物。研究表明，橡胶合成在含胶细胞的橡胶颗粒中进行，由橡胶转移酶催化橡胶分子延伸。橡胶颗粒含量最多的蛋白是小橡胶颗粒蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)，鉴定杜仲胶生物合成中发挥功能作用的SRPP/REF基因并阐明其作用机制，具有重要的科学意义。项目组基于杜仲转录组测序和全基因组注释数据库，克隆了5个杜仲小橡胶颗粒蛋白编码基因EuSRPP1、EuSRPP2、EuSRPP3、EuSRPP4和EuREF8。结构分析证明，5个基因均具有SRPP/REF保守结构域，均无信号肽。构建EuSRPP1，EuSRPP3，EuSRPP4基因分别与GFP基因融合的表达载体转化烟草，证明了克隆的基因编码蛋白存在于细胞膜上。通过构建EuSRPP1基因原核表达载体在大肠杆菌表达蛋白制备抗体，利用胶体金标记免疫电镜观察，证明EuSRPP1蛋白定位于杜仲含胶细胞的橡胶颗粒。EuSRPP1、EuSRPP2、EuSRPP3、EuSRPP4和EuREF8基因时空表达特征分析，揭示了不同SRPP/REF基因表达与杜仲含胶量及胶分子量之间的相关关系。对转基因杜仲组培苗和愈伤组织EuSRPP1和EuSRPP4基因超量和干涉表达水平、以及含胶量和分子量分析，证明EuSRPP1基因在杜仲胶生物合成和橡胶分子延伸中均发挥了功能作用，EuSRPP4基因在杜仲胶分子延伸中发挥作用。根据基因组注释数据库中与EuSRPP1、EuSRPP4和EuREF8同源性最高基因的启动子分析表明，都共同具有光响应元件、ABA、GA和MeJA等激素响应元件、低温、干旱、厌氧等逆境响应元件。外源激素GA3处理，显著提高杜仲幼苗EuSRPP2和EuSRPP3基因表达量，同时提高了幼苗含胶量和胶分子量。项目组克隆了含STLNSHNLPILR序列的EuLEGA-like基因，初步分析发现该基因可能属于Cupin RmlC-like超家族保守结构域的dTDP糖异构酶基因，参与L-鼠李糖合成。杜仲胶颗粒组分分析表明，含有的6种糖脂中，硫代异鼠李糖二酰甘油（SQDG）含量最多。这些研究结果为阐明杜仲胶颗粒形成和杜仲胶生物合成机理提供了重要的基础资料，也为杜仲基因工程改良提供理论依据和目标基因。