嗜线虫致病杆菌CpxR基因失活提高杀菌活性的机理研究

以自行分离鉴定的具有较高杀菌活性的嗜线虫致病杆菌YL001菌株为材料，采用基因置换技术，构建CpxR基因失活突变菌株；通过HPLC技术对突变菌株与野生菌株代谢谱的差异性进行分析，并测定主要杀菌成分的含量变化；采用现代色谱分离、波谱鉴定技术，结合生物活性追踪对突变菌株中的杀菌活性成分进行分离、鉴定；利用RT-PCR技术分析与主要杀菌成分合成相关的nrps、xcnA-N、pta、ackA、lrp、ompR及rpoE基因的mRNA；通过基因敲除技术，分别构建与乙酰磷酸及CpxR磷酸化有关的ackA 及ackA-pta缺失突变菌株，分析突变菌株与野生菌株中杀菌成分的含量，阐明CpxR基因失活提高杀菌活性的原因及乙酰磷酸对抗生素产生的影响，发现新的杀菌活性成分，为共生菌次生代谢物的代谢调控及隐藏天然产物的产生提供线索，为利用共生菌资源和创制具有自主知识产权的新型农药打下良好基础。

在X. nematophila中，CpxR负向调控其抑菌活性。因此，本项基于ΔcpxR突变株与野生菌株在抑菌活性、主要抑菌物质生物合成基因的转录与表达及产生的差异分析，以明确了cpxR基因突变显著提高其抑菌活性的机理。. 1.通过同源重组技术成功构建cpxR和ackA-pta基因缺失的突变菌株ΔcpxR和ΔackA-pta；. 2. cpxR和ackA-pta基因缺失可不同程度的提高YL001菌株的抑菌活性。其中，ΔcpxR突变株对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为30.89 mm，较野生菌株提高了33.31%，对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制率为90.26%，较野生菌株提高了20.31%，对番茄灰霉病的保护与治疗效果分别为79.07%和77.24%，较野生菌株分别提高了13.74%和14.67%；ΔackA-pta对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制率为89.04%，是野生型YL001的1.20倍； . 3. cpxR和ackA-pta基因缺失可显著影响主要抑菌物质XCNs和PAX生物合成基因xcnA-N和paxABCT的转录与表达。其中，cpxR基因缺失可显著提高XCNs生物合成基因xcnA-L的转录与表达水平，降低负责XCN1向XCN2转化基因xcnM和xcnN的转录与表达水平。ΔcpxR突变菌株中，xcnA、xcnM和xcnN的表达水平分别是野生菌株的1.8、0.6和0.8倍；ΔcpxR突变菌株中，PAX的生物合成基因paxA和paxT的表达量明显增大，其中paxT的表达量为野生菌株的2.28倍；.cpxR基因缺失可显著降低与抑菌物质产生有关的envZ和ompR基因的转录与表达水平，提高lrp的转录与表达水平。ΔcpxR突变菌株中，envZ、ompR和lrp的转录表达水平分别是野生菌株的0.35、0.18和2.8倍。. 4. cpxR基因缺失可显著提高嗜线虫致病杆菌主要抑菌物质XCNs与其合成前体（XCN1、XCN2、PXCN3、PXCN4、PXCN6）的含量。其中，ΔcpxR突变菌株中XCN1和XCN1的含量较野生菌株提高了3.84和12.56倍。. cpxR直接或间接负向调控主要抑菌物质XCN生物合成基因xcnA-L的转录与表达，正向调控xcnM和xcnN的转录与表达，从而促进XCN1的产生，提高其抑菌活性。