小麦抗冻蛋白TaAFPIII诱导型启动子的克隆与功能分析

诱导型启动子可以控制目的基因的表达。利用它改造植物既不会造成植物体内资源的浪费，又不会干扰植物的正常生理代谢。本课题前期克隆到的一种小麦新型抗冻蛋白TaAFPIII基因，鉴于该基因序列在植物中首次发现，并通过转基因烟草证明该基因具有显著的抗冻功能，因此有必要深入探索其转录调控的机制。本项目拟通过荧光定量PCR技术确证该基因与低温的直接调控关系，探明该基因与冷诱导调控信号分子ABA之间的联系，进一步采用染色体步移技术分离该基因的启动子，结合生物信息学分析，使用缺失突变和点突变方法，构建多个包含不同调控元件的真核表达载体，并在烟草中进行验证，旨在获得调控TaAFPIII基因启动子的核心序列。通过本项目的开展，可以克隆小麦抗冻蛋白TaAFPIII诱导型启动子并对其进行功能分析，这对揭示植物的抗冻调控机制有着重要的意义。为今后采用遗传工程培育植物抗冻新种质资源奠定基础。

为了更深入的研究植物抗冻机制，对冷诱导启动子的研究成为人们关注的热点。本研究通过荧光定量PCR对不同温度和不同激素处理的小麦抗冻蛋白AFPIII进行表达分析，同时克隆出AFPIII启动子序列，比较已知耐寒基因wcs120启动子的顺式元件，从而找出小麦抗冻蛋白在冷驯化过程中可能的调节代谢途径，最后通过转基因烟草验证启动子在异源植物中的功能。结果表明该启动子在低温下有高诱导表达，并且受茉莉酸甲酯调控，利用Tail-PCR法扩增出ATG前826个碱基，通过顺式元件分析可能与CBF调控途径相关，并且与wcs120启动子相比的有不同的调控途径。转基因实验表明低温下该启动子在烟草中表达量很低，并没有小麦中那样高表达，可能存在问题是小麦和烟草调控途径不同，低温条件不够，烟草在低于10℃条件下就停止生长。本研究通过对小麦AFPIII启动子进行扩增，分析其可能的代谢途径，同时发现烟草不适合作为检测抗寒启动子的模式植物。为后期实验提供借鉴和思路。