人聚合酶Pol δ小亚基p12生化功能研究

人DNA聚合酶Pol δ是真核生物染色体DNA复制过程中的一个主要复制酶，并在参与其它多种形式DNA修复过程中起着关键作用。目前普遍认为，人Pol δ是由四个亚基p125、p50、p68和p12构成的异源四聚体，推测小亚基p12有可能在DNA复制和损伤修复过程中调控着Pol δ的酶学功能以保证DNA复制的准确性，避免染色体突变的发生。本项目拟通过分析小亚基p12在DNA复制过程中的酶学功能，研究p12活性区域对Pol δ-DNA合成的调控，以明确p12对Pol δ-DNA复制的调控机制。同时，通过观察各亚基在细胞亚核内DNA损伤点上的共定位，阐明细胞内p12在Pol δ-DNA损伤应对响应机制中的作用。这些研究将对我们了解人类疾病和癌症的发病机理以及发现新的诊断治疗手段方面具有十分重要的意义。

人源DNA聚合酶δ（Pol δ）是真核生物染色体DNA复制过程中主要复制酶之一，并在参与多种形式DNA修复过程中起着关键作用。目前普遍认为，人源Pol δ是由p125、p50、p68和p12四个亚基构成的异源四聚体，推测p12有可能在DNA复制和损伤修复过程中调控着Pol δ的酶学功能以保证DNA复制的准确性。本基金项目研究通过建立人源Pol δ大规模制备和分离纯化平台，对所获得的Pol δ各亚基不同组合的蛋白复合物进行体外生化功能分析：在Poly(dA)/oligo(dT)为引物/模板和单链M13 DNA模板上的DNA活性分析显示，缺失了p12的三亚基蛋白复合物的活性与全酶相比均有显著下降，揭示了p12在DNA复制过程中扮演着十分重要的角色；通过比较由尿嘧啶引发DNA损伤模板上的碱基切补修复活性，发现p12具有调控Pol δ单核苷酸切补修复与多核苷酸切补修复比例的功能；首次证实了p50也能和PCNA发生捆绑反应，并以此为依据，提出了一个新的Pol δ-PCNA蛋白复合物之间相互反应的网络模型。同时，本基金项目也对小亚基p12的多泛素化修饰途径进行了初步探索：通过由四个不同性质层析柱组成的E3查找系统，成功地鉴定出唯一能介导p12多泛素化反应的E3连接酶 RNF8，其相应的E2/E3调控途径为Ubc13/Uev1a/RNF8；在应用免疫亲和层析柱查找由UV引发DNA损伤的细胞内与Pol δ形成复合物的相关蛋白时，也鉴定出RNF8是一个Pol δ的关联蛋白，实验表明RNF8是通过四个亚基与Pol δ发生捆绑反应，它与E2交联酶UbcH5c协同介导p50亚基单泛素化反应；亚细胞共定位实验发现，Pol δ和RNF8以共定位方式被募集到由UV射线引起的DNA损伤区域。以上研究初步明确了小亚基p12在Pol δ-DNA复制中的调控机制，阐明了p12泛素化修饰在调控Pol δ-DNA损伤应对响应机制中的作用，对从人类癌症发病的起因揭示：由于Pol δ功能改变而使得遗传基因组不稳定，进而导致肿瘤发生的机制具有十分重要的科学意义。同时，拥有自主知识产权的人源Pol δ大规模制备和分离纯化平台的建立，也极大地解除了制约全世界科研工作者对人源Pol δ功能进行深入研究的瓶颈，即：获得大量、高纯度、具生物活性的Pol δ四亚基蛋白复合物。