基于特异性识别G-四链体的噻唑橙衍生物：构建、作用机制及活细胞水平研究

G-quadruplex DNA is closely related to cancer indications and has an active role in biomedical applications such as anti-tumor drug targets. At present, the study on the existence and structural changes of G-quadruplexes remains at the in vitro solution level, and empirical studies under the cellular environment are still lacking. Through previous studies, it has been found that incorporating benzyl group at the meso position of thiazole orange can increase the selectivity for G-quadruplex and reduce cytotoxicity. The project is intended to establish a simple synthetic method for the formation of a meso-substituted thiazole orange derivative. The core of the project is to “target living cell endogenous G-quadruplex structures and guide the establishment of a middling substitution thiazole orange molecular library to screen out high selections. "High-sensitivity, low-cytotoxicity G-quadruplex recognition probes" enable the specific visualization of endogenous G-quadruplex structures in living tumor cells. At the same time, the interaction mechanism between the probe and the G-quadruplex was studied through molecular modeling and solution system, and the structure-activity relationship of the probes was revealed, providing the screening and orientation synthesis of G-quadruplex aptamers or probes. Theoretical basis, and provide a path for the development of targeted G-quadruplex anti-tumor therapy.

G-四链体DNA与癌症指征关系密切，在抗肿瘤药物靶点等生物医学应用方面具有积极作用。目前，针对G-四链体的存在及其结构变化研究仍停留在体外溶液层面，细胞环境下的实证研究尚有欠缺。通过前期研究发现，在噻唑橙的中位引入苄基可以提高对G-四链体的选择性、降低细胞毒性。项目拟验证形成一种中位取代噻唑橙衍生物的简便合成方法，核心是“以活细胞内源G-四链体结构为靶向，导向建立中位取代噻唑橙分子库，筛选出高选择性、高灵敏度、低细胞毒性的G-四链体识别探针”，实现对肿瘤活细胞内源G-四链体结构的特异性可视化检测。同时，通过分子模拟和溶液体系研究探针与G-四链体的相互作用机制，揭示该系列探针的构效关系，为G-四链体适配体或探针的筛选和导向合成提供理论基础，并为开发靶向G-四链体抗肿瘤治疗方法提供实现路径。

G-四链体是一种富含鸟嘌呤(G)序列所形成的一种特殊的DNA二级结构，是调控基因的主要限制结构，抗肿瘤药物的潜在靶点。因此以G-四链体为靶点的小分子荧光探针的开发，对于研究G-四链体在生物体内的生物功能及靶向抗癌药物具有重要的意义。本项目执行三年期间，取得以下进展：. 1. 建立了新的制备中位取代五甲川菁染料衍生物的合成技术，并合成了不同母核的新型甲川链取代五甲川菁染料20余种，丰富了中位取代菁染料分子库。用1H NMR、13C NMR、高分辨质谱及X-射线单晶衍射等技术表征了化合物结构。. 2. 开展了中位取代一甲川菁噻唑橙与G-四链体DNA相互作用的研究。全面系统的运用紫外-可见分析光谱、荧光光谱、圆二色谱、计算机模拟计算等分析检测技术，同时在细胞水平，如毒性试验、荧光成像等，筛选出了荧光响应最强、检出限最低的探针meso-Bn-2TO，在构效关系的指导下深入探讨了G-四链体DNA与探针的相互作用机制。. 3. 同时探究了甲川链取代三甲川菁染料和甲川链取代五甲川菁染料与G-四链体DNA的相互作用机制，筛选出了4例效果较好的探针。结果表明，相对于不同甲川链长度的菁染料而言，在菁染料甲川链上引入适当的取代基能在降低菁染料类探针背景荧光的同时增强探针对G-四链体DNA的结合能力和选择性，而且，随着甲川链的增长，探针对G-四链体的亲和性会逐渐下降，选择性却得到提高。我们所开发的甲川链引入了苯并噻吩的五甲川菁A13，可对特定G-四链体c-myc实现比色和荧光“OFF-ON”双信号的特异性可视化识别，验证了我们将杂环引入甲川链的设想的正确性。. 本项目完成了高灵敏度、高特异性的G-四链体探针的分子设计及筛选，探究了该系列探针的构效关系，为基于菁染料骨架的G-四链体荧光探针的构建提供了理论基础，在抗肿瘤药物靶点等生物医学应用方面具有积极作用。项目执行期间，目前共发表SCI论文5篇、CSCD论文1篇，培养硕士研究生2名。