MDMA对培养新生大鼠心室肌细胞connexin43 蛋白磷酸化状态及其胞内[Ca2+]振荡模式的影响

MDMA的毒性主要作用于神经系统和心脏，导致严重的心律失常，尤其室速和室颤是中毒死亡的主要原因。本项目拟应用细胞体外培养技术，构建MDMA对新生大鼠心肌细胞的体外染毒实验模型；从细胞水平研究MDMA染毒前后，心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43以及蛋白激酶PKCα，两种重要蛋白质总量表达的情况及其磷酸化状态的变化；实时动态检测MDMA染毒前后，心室肌细胞内[Ca2+]振荡在幅度和频率上变化；综合讨论心肌细胞经MDMA染毒后，Cx43蛋白磷酸化状态改变、蛋白激酶PKCα磷酸化状态改变与[Ca2+]振荡模式变化，这三者之间的内在联系。从分子毒理学角度入手，建立分子水平的MDMA染毒模型，深入揭示MDMA致心律失常发生的细胞分子机制，探索相应的法医分子毒理学诊断与鉴定标准，为MDMA致心律失常的法医学鉴定提供系统的理论基础。

目前，摇头丸在世界范围内的滥用形势日趋严峻，并主要流行于青少年人群中。近年，因服用摇头丸导致死亡的案例不断上升，造成了严重的公共卫生问题。摇头丸的主要成分为3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺(MDMA)。国内外研究及临床数据表明MDMA具有心血管毒性。MDMA急性中毒可导致显著的心血管功能异常，如心律失常等。但是相关的毒性机制却尚未探明。本项目通过对 MDMA 与心肌细胞缝隙连接蛋白的影响进行了研究,探讨 MDMA 引起心肌毒性的分子机制。本项目主要利用体外原代培养新生大鼠心室肌细胞并构建体外 MDMA 急性染毒模型,对不同浓度 MDMA 急性染毒引起的心室肌细胞连接蛋白43（ CX43） 的蛋白表达含量、分布以及磷酸化状态进行观察。该部分实验结果表明MDMA 急性染毒组心肌细胞总连接蛋白 43 含量显著下降。高浓度 MDMA 染毒可引起心肌细胞缝隙连接间正常分布的连接蛋白 43 的含量下降，并引起分布异常，高浓度 MDMA 还可导致连接蛋白 43 磷酸化状态改变,表现为非磷酸化状态比例上升。针对MDMA引起CX43磷酸化状态的改变，本项目进一步对CX43特异性磷酸化位点Ser368的磷酸化状态在急性MDMA染毒条件下的影响展开研究，并相应地对磷酸化激酶C的活性以及心室肌细胞内钙离子浓度的变化进行了观察。研究结果显示高浓度MDMA可引起磷酸化位点 Ser368 的磷酸化水平增加,心肌细胞内 PKCα 磷酸化水平明显升高但PKCα含量并未发生明显改变，同时还引起心肌细胞内钙振荡模式的改变和钙离子浓度的上升。本项目较为系统地对MDMA直接作用于大鼠心室肌细胞引起心肌细胞毒性的机制进行了研究。项目成果证实了MDMA的直接心肌细胞毒性作用，可引起心肌细胞连接蛋白43表达水平的改变以及分布异常，并影响心肌细胞内钙稳态，引起相关蛋白激酶活化，间接导致连接蛋白43磷酸化水平异常，诱发心肌细胞电传导异常,从而导致心律失常的发生。本项目在国内外首次提出MDMA直接作用于心肌细胞引起心电功能紊乱的分子机制，为进一步揭示MDMA的毒理机制奠定了基础，提出了研究方向。