钙调控蛋白与核因子κB在不同浓度MDMA急/慢性染毒大鼠心肌细胞内钙失衡机制中的作用研究

The cardiotoxcity of MDMA has been determined widely, it can cause sudden death due to the cardiac arrhythmia. In our prior study, we have determined that MDMA altered the intracellular calcium concentration and oscillation patterns. The findings indicated that calcium dyshomeostasis played an important role in the cardiotoxcity of MDMA. According to the reference, it is our hypothesis that the feedback regulation mechanism between calcium regulation proteins and nuclear factor-κB may involve in the calcium dyshomeostasis induced by MDMA. In this study, primary cell culture of neonatal ventricular myocytes would be treated with MDMA at different concentrations: 1. to observe the alteration of intracellular calcium signal; 2. to investigate the expression level and phosphorylation status of calcium regulation proteins in the cells when exposed to MDMA; 3. to find out the relationship between intracellular calcium signal, calcium regulation protein, PKA/PKC and NF-Κb activity. Different specific antagonist would be also used for identify the feedback pathway of Ca2+-PKA/PKC-NF-κB-Calcium regulation proteins as the new mechanism on the cardiotoxicity of MDMA.

MDMA已被证实具有显著的心肌毒性作用，可致心电功能紊乱而引起猝死。在本课题研究组前期实验中发现MDMA可引起心肌细胞内钙浓度及钙振荡模式的改变，证实MDMA致心肌毒性作用机制与细胞内钙平衡紊乱有关，但其具体机制不明。根据大量文献线索，推测钙调控蛋白、核因子κB在MDMA致心肌细胞钙失衡的机制中发挥重要作用，且其之间可能存在反馈调节。本研究拟利用体外培养心肌细胞急/慢性染毒模型，①观测不同浓度MDMA急慢性染毒致心肌细胞钙信号改变的差异性；②观测染毒后钙调控蛋白量及磷酸化状态的改变，及相应抑制剂干预后钙信号的变化情况，阐明钙调控蛋白在其心肌毒性中的作用；③观测染毒后心肌细胞内钙信号、钙调控蛋白、PKA/PKC及核因子κB活性变化之间的关联性，结合多种拮抗剂的干预，求证“Ca2+-PKA/PKC-NF-κB-钙调控蛋白反馈调节通路”是否为MDMA引起心肌细胞钙失衡的新机制。

毒品摇头丸在世界范围内盛行，其主要成分MDMA的毒性研究已受到广泛关注，也是法医学关注的焦点之一。当前研究已经证实MDMA具有直接的心肌毒性作用，可导致心律失常等心电功能紊乱而引起猝死。本课题组前期实验中发现MDMA可引起心肌细胞内的钙超载及振荡模式改变，证实MDMA的心肌毒性作用与细胞内钙离子失衡有关，但具体机制尚未明确。在本项目中，我们研究了不同浓度MDMA急性染毒时细胞内钙离子浓度及钙振荡模式的变化，重点观察参与维持细胞内钙离子稳态的钙调控蛋白在MDMA心肌毒性中的角色，以及NF-κB活化的可能途径及其对钙调控蛋白的影响，进一步探讨MDMA致心肌毒性的作用机制。结果发现：24h内MDMA的毒性作用与其作用时间呈正相关；激光共聚焦显微镜显示MDMA染毒组心肌胞浆内钙离子振荡波形呈不规则改变，波幅增大，振荡剧烈，频率不规则，部分波宽有所增加；MDMA染毒使心肌细胞内的RyR2、SERCA2a及NCX1的蛋白及基因表达均上调，而LTCC通道、PLN的蛋白及基因表达下调，且有剂量依赖性；MDMA染毒组中NF-κB活性增加，PKCζ及核内p-p65（Ser311）含量均有所上升；结合NF-κB抑制剂PDTC的干预，细胞内钙振荡波幅较染毒组减低，RyR2 及SERCA2a、NCX1 mRNA及蛋白表达较MDMA染毒时有所下降，PLN无明显变化，而CACNA1c的表达上调。本项目证实MDMA可通过引起心肌细胞内钙信号的变化，钙离子浓度升高，发挥其心肌毒性，MDMA致心肌细胞内钙超载的机制，与心肌细胞内钙调控蛋白的变化有关，其中主要是与RyR2的表达上调有关，此外，MDMA可以通过PKCζ-NF-κB途径使细胞内NF-κB活性上调，而NF-κB活化后，可对心肌细胞内的钙调控蛋白发挥作用，整体上加剧细胞内钙离子超载。