中缅边境恶性疟原虫K13螺旋桨蛋白对青蒿素类药物的抗药性决定位点的筛选和验证

The artemisinin based combination therapies (ACTs) was the first line drug against Plasmodium falciparum used in malaria endemic area recommended by World Health Organization (WHO). However, five countries including Myanmar, Laos, Cambodia, Vietnam and Thailand in Great Mekong Subregions (GMS) have reported artemisinin-resistant P. falciparum in 2014, which was a great challenge to the China-Myanmar border, and thus influence the progress of malaria elimination in China. Previous study has indicated that Kelch 13-propeller protein (K13) correlates with the artemisinin resistance in GMS, but the crucial mutation site or loci still remain unknown. In this project, we have investigated and analysed the prevalence of single nucleoside polymorphism (SNP) of K13 gene and selection of crucial resistance gene of P. falciparum against artemisinins in China-Myanmar border. This project will study above mentioned questions via combination with SNP data of K13 gene, clinical drug efficacy and in vitro biochemical confirmation, which aims to provide direct evidence for rational administration of antimalarial guidance and containment of artemisinin resistance in China-Myanmar border.

以青蒿素药物为基础的联合疗法（ACTs）是世界卫生组织（WHO）推荐的在疟疾流行区针对恶性疟治疗的一线药物。但截止到2015年底，WHO报道在东南亚湄公河区域（GMS）中除中国云南外，其余5个国家均发现了青蒿素抗性虫株。一旦抗性蔓延至我国中缅边境地区，将对该地区疟疾的防控造成巨大挑战，进而影响到我国消除疟疾进程。研究表明恶性疟原虫13号染色体上的螺旋桨蛋白（K13）与其抗性的产生直接相关，但目前尚无实验数据支撑具体的决定性突变位点或突变区域。本项目在综合文献和前期工作的基础上，探索中缅边境恶性疟原虫对青蒿素类药物的K13基因的单核苷酸多态性（SNP）的流行特征、人群流行规律和K13抗性决定位点的筛选，并通过体外生化实验验证这一假说，为中缅边境地区科学合理的指导用药和抗性的蔓延、扩散的控制提供直接的实验证据。

本课题通过现场流行病学、分子生物学、生物信息学等方法，对中缅边境恶性疟原虫对青蒿素类药物的K13蛋白的人群流行特征、人群基因时间和空间分布规律等进行了研究。对中国本地、东南亚输入和非洲输入的虫株进行了分子进化差异性分析，结果发现中缅边境主要流行F446I位点（43.5%），非洲主要为A578S位点（13.0%）。所有突变样本在时间分布上并无统计学差异（p>0.5）。共有18个K13的不同SNP位点报道，其中有3个同义突变，其余15个为非同义突变。.微卫星结果显示F446I突变的虫株在TAA109微卫星位点数值远低于WT和其他突变株（He = 0.112 ± 0.007）；而从地理来源上看，TAA109在东南亚(He = 0.139 ± 0.012)和非洲来源的虫株具有明显差异(He = 0.603 ± 0.044)。.不同SNP位点关联分析结果显示与哌喹抗性有关的E415G在4个样本中检测到，分别来自东南亚的F446I（缅甸）、V581I（老挝）和P574L（缅甸）。pfpm2拷贝数分析发现只有F446I（盈江）和V581I（江城）的位点有多重拷贝，提醒该地区可能有哌喹抗性产生的可能。pfmdr1的突变率最高，共22份有K13突变的样本中均检测到有pfmdr1的突变，显示该位点和K13的突变具有较大的关联性。.综合临床药效监测数据和分子标记位点结果，根据世界卫生组织关于抗药性定义，有2例病例（F446I）出现第3天阳性，确认F446I为中缅边境恶性疟原虫抗药性决定位点。.摸索了野生型、C580Y和F446I三个重组蛋白体外构建、培养和纯化条件，为下一步体外蛋白功能严重和结构生物学奠定了基础。