中缅边境间日疟原虫抗药性体外测定与抗药性基因的关联研究

China- Myanmar border is the main area where malaria is imported to China, where we have found that dramatic increases of vivax malaria cases recently. However,whether this is caused by drug resistance has not been systematically studied. In this proposal, we aim to identify the chloroquine and other drugs target genes by both in vitro drug sensitivity studies and the correlation study with the variation of updates potential drug resistance genes in an attempt to identify drugs resistance targets and further to develop the molecular tools to monitor drug resistance. The result of this study, molecular methods and processes to monitor the drugs resistance, will be valuable tools for drugs resistance monitoring. A better understanding of drug resistant in China- Myanmar border will be benefit to guide the malarial therapy and benefit monitoring malarial drug resistance, guide safe and reasonable malarial therapy.

中缅边境是我国输入性疟疾的主要输入地。我们建立的中缅边境疟疾观察点发现，近年来间日疟病例大幅增加，是否由抗药性产生导致，有待研究探明。准确、有效的疟原虫抗药性监测是实现这一目标的前提，但目前缺乏有效的分子监测手段，对氯喹等抗疟药物的抗性监控难以进行。本课题拟在前期已建立的疟疾研究现场，进行间日疟原虫对常用的几种抗疟药的体外抗性测定，结合最新报道的在世界其他地区发现的被筛选的基因的变异研究，关联二者的关系，探索出本地间日疟原虫的抗药性的分子标记。研究出适合本地抗药性监控的分子手段及方法，以达到监测抗药性的目的。本研究探明的疟原虫抗性种群结构，将为临床用药和抗疟药物配伍策略提供理论依据。创建分子监测抗药性的流程和方法，建立分子抗性监测的平台，为抗药性监测服务。研究将对我国乃至全世界疟疾流行区抗性监测、抗疟疾药物合理安全使用具有指导意义。

近年来中缅边境间日疟原虫导致的疟疾大幅增长。疟原虫的抗药性机理研究观察非常必要。我们按照课题设计要求进行了如下工作，并且进行了拓展。.我们进行了追踪了新变种的起源和传播及抗药性研究两方面的研究工作。抗药性研究工作除了体外抗药性测定，我们拓展了体内抗药性观察。.研究结果显示：.中缅边境密松返回的务工流动人群的基因多态性高于啦咱本地人群。说明密松流动人群扩散幅度高于本地人群。采用间日疟原虫裂殖子成熟试验，测定观察了连续4年的间日疟原虫的体外药物敏感性。共计对100株间日疟原虫临床分离株进行了8种抗疟药物的体外药敏试验。测定了疟原虫对氯喹、甲氟喹、咯萘啶、哌喹、奎宁、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素的半数抑制浓度，中位数分别为84.2 nM、34.9 nM、4.0 nM、22.3 nM、41.4 nM、2.8 nM、2.1 nM 和2.0 nM。间日疟原虫临床分离株中有12株超过了氯喹耐药的 IC50临界值(220nM)。体内观察研究，也发现了氯喹的抗性情况，这个与体外抗药性测定的结果相互印证。但是，属于少数情况。总体情况还是对氯喹敏感的。.对中缅边境地区，从密松返回到腾冲的流动人群的样本及啦咱地区本地居民样本比较，也发现了该地区疟原虫的pvdhfr 和 pvdhps 基因突变严重，说明疟原虫对磺胺多辛-乙胺嘧啶敏感性降低明显。对疟原虫 pvdhfr 和 pvdhps 基因进行了微卫星研究表明两个地区的这两个基因，都受到选择，多重突变常见。GTP 环水解酶 I (pvgch1)基因没有拷贝数增加。pvmrp1基因分析结果显示Y1393D固定，G1419A接近固定(97.8%) ，V1478I罕见(2.2%)。对52个样品的pvmdr1基因进行测序，发现12个氨基酸取代，其中两个(G698S和T958M)是固定的，98.1% 的分离株存在M908L，3.8%的分离株存在Y976F和F1076L。pvmdr1基因的扩增仅在4.8%的样本中检测到。对59个寄生虫分离株的pvcrt-o 序列测定发现，32.2%的分离株在第10位有一个赖氨酸插入。在我们的样本中，pvmdr1中的M908L突变与氯喹、甲氟喹、咯萘啶、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的敏感性降低有关。