细胞黏性连接及紧密连接处Nectin-AF-6系统及claudin-ZOs系统蛋白质相互作用的三维结构基础

用多维核磁共振波谱研究细胞黏性连接及紧密连接处Nectin-AF-6及claudin-ZOs系统蛋白质相互作用的三维结构基础。通过测定相关蛋白质的三维结构，拟回答以下科学问题：Nectin系统在细胞黏性连接处如何形成同二聚体与异二聚体。阐述细胞黏性连接两大体系E-cadherin－?-catanin-?-catanin系统，及Nectin－AF-6/afadin系统蛋白质-蛋白质相互作用相互识别的结构特征。Nectin－AF-6/afadin系统信号传导通路上若干蛋白质激活的三维结构基础。ZOs蛋白质聚合与跨膜蛋白，与转录因子的相互作用。研究蛋白质相互作用过程结构与动力学的变化，以及功能意义。

我们解析了ZO-1第二个PDZ 结构域的核磁结构。ZO1PDZ2通过domain-swapped的方式形成非常稳定的同二聚体，而domain-swapping的形成是由于β2a 与 β2b之间的Loop区太短，3－6个氨基酸的插入突变可以使ZO1PDZ2由同二聚体变为单体。将MDCK 细胞中内源的ZO-1用RNAi knockdown会导致细胞紧密连接装配延迟。重新转入野生型基因可在konckdown细胞中恢复紧密连接装配，而突变基因的转入不能恢复细胞的上述功能。据此我们认为ZO1PDZ2以domain-swapping方式形成二聚在紧密连接装配中起了关键作用。. 我们解析了VAV2的SH2结构域的核磁结构。首次发现了VAV2的SH2结构域可以与Arf6, RhoA 双功能的GAP Arap3的C 末端磷酸化位点Y1404 及Y1408结合。GST-pulldown、免疫共沉淀、细胞共定位等实验证实了Arap3是Vav2的新的作用对象。我们解出了VAV2的SH2结构域与Arap3 的C 末端肽的复合物结构。小肽pY+3位的Val残基的侧链与位于这个疏水口袋表面的残基存在大量的疏水相互作用决定了识别的专一性。. 我们研究了与小GTPase Arf6, RhoA 相关的双功能的GAP Arap3，以及与GTPase Arf6相关的GEF的结构与功能。ArfGAP结构域的溶液结构显示Arap3的第二个PH结构域对ArfGAP的活性有显著促进作用，第二个PH结构域中的Arg445对于PH-ArfGAP的活性十分关键。我们发现Arap3第一个PH结构域在Arap3的激活过程中发挥重要作用，它不与磷脂PG,PC,PS结合，与PIP2结合。我们目前已经获得ARAP3的RhoGAP结构域的晶体，并收集了衍射数据，正在作结构修正。. Ponsin (CAP)参与信号传导及细胞骨架的组织。我们完成了Ponsin的第一和第二双SH3结构域核磁结构解析。发现这两个结构域间由一段柔性的肽段连接，二者间无固定取向。我们证明Vinculin两个富含脯氨酸的肽段与Ponsin的双SH3结构域结合。我们分别解出两个SH3结构域与Vinculin富含脯氨酸肽段的复合物晶体结构，通过小角散射实验，在溶液状态下研究了Vinculin全长蛋白与Ponsin双SH3结构域的复合物的结构。