锌在梅毒螺旋体Tp0751结构与功能中的作用研究

T. pallidum membrane protein Tp0751 plays a role in degrading host components and stimulating inflammatory reactions, and is a crucial pathogenesis factor in the host tissue colonization and bacterial dissemination. Recent research indicates that the proteolytic activity of Tp0751 is a zinc-dependent, membrane-associated protease that exhibits metalloprotease-like characteristics. However, whether Tp0751 is a zinc-dependent metalloprotease remains unknown and thus depends on its structure determination. Moreover, the role of zinc in maintaining the other function of Tp0751 such as attaching to host cells,stimulating inflammatory reactions is still need to be investigated. To test this prediction, based on our present research, we will use X-ray crystallography to analysis its three-dimensional structure, and further determine its function as a metalloprotease. And we will use site-directed mutagenesis by mutation of the HEXXH motif to HQXXH,AEVIH and HEVIA to analyze whether Glutamate at position 199 and Histidines at positions 198 and 202 bind to znic and maintains the stucture and funcion of Tp0751. Furthermore, we will design protease inhibition assays to probe the effect of various broad-spectrum protease inhibitors on the attachment, proteolytic and stimulating inflamatory activity of Tp0751. This project represents the first complete research on the structure and function of Tp0751, and thus provides a novel insight and model into the research of the mechanism of T. pallidum pathogenesis and treatment.

Tp0751是Tp重要的致病因素，锌可能在维系Tp0751的蛋白水解活性中发挥重要的作用。但是，Tp0751是否为锌依赖金属蛋白尚需要利用蛋白结构研究进行确证，同时锌在维系Tp0751其它生物学功能中的作用也尚有待进一步研究。为了验证这种设想，本项目在我们前期研究的基础上和结合国外最新研究进展，利用X 射线晶体学技术解析蛋白质的三维空间结构；将蛋白的锌依赖活性区HEVIH分别点突变为HQVIH、AEVIH和HEVIA，以分别考察199位天冬氨酸、198位和202位组氨酸在结合锌及及维持蛋白质结构与功能中的作用；设计抑制实验，研究加入金属抑制剂后对蛋白黏附、水解及促炎症活性的影响；总结以上信息，分析锌在维系Tp0751的结构及生物学功能如黏附、水解及促炎症活性中的作用及机制。本项目的完成不仅能为系统研究Tp0751的功能奠定基础，而且也为Tp致病机制研究及梅毒的治疗研究提新的方向和靶标。

进行梅毒螺旋体的致病因子的筛选和蛋白质的结构及功能的探讨是进行梅毒致病机制研究的关键。本课题组近年来主要从事梅毒螺旋体的诊断与防治的相关研究。申请者近年来一直在进行Tp0751蛋白的研究和其他致病蛋白的筛选。在本项目的支持下，我们进行了Tp0751蛋白晶体的培养期望解析其空间结构，同时对其水解功能进行了进一步的研究，通过构建野生型和突变型Tp0751蛋白对其水解活性进行分析，研究表明Tp0751蛋白为金属依赖水解蛋白酶，其活性功能可能与HEXXH中H202有关，为进一步深入研究其功能奠定了良好的基础，目前正在加紧进行蛋白质晶体的优化培养，希望首次解析该蛋白结构；为了进一步研究梅毒的致病机制，我们做了延伸研究，进行了糖尿病合并梅毒的研究，试图进一步了解梅毒对于糖尿病病人的疾病发生发展的影响，我们率先成功构建糖尿病合并梅毒兔模型，初步分析合并感染能明显加重感染病程的进展，其中硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）可能发挥了重要的作用，为进一步阐明梅毒的致病机制和研发抑TXNIP药物为梅毒、DM并发症治疗奠定基础；同时我们还进一步进行了其他致病因子和诊断预防靶标的筛选，成功筛选出Tp0993和Tp0844两个梅毒螺旋体膜蛋白，可望作为梅毒的诊断和致病因子研究新的靶标。