拟南芥CFR1转变体细胞命运的细胞和分子机制研究

During in vitro organogenesis, the somatic cells from plant tissues have the capacity to reverse their state of differentiation and form an entire plant through the processes of dedifferentiation and redifferentiation. In this process, the somatic cell fate switch is regulated by both extrinsic and intrinsic factors. However, little is known of the molecular mechanism underlying the somatic cell fate switch on organ regeneration in vitro. To identify genes linked to cell fate switch, we have isolated a cfr1 mutant with the ability to restore callus formation from the populations of EMS mutagenesis in the slr background (slr is a mutant defective in callus initiation). By map-based cloning, we identified CFR1 gene and the pCFR1::CFR1 construct completely complemented the cfr1 mutant phenotype. We will try to dissect the cytological basis of somatic cell fate switch with cell type specific makers combined to reliable microscopic imaging, and investigate whether the CFR1 substrates or products have an effect on change of cell fate using GC-TOF analysis. Moreover, we will explore the signaling pathways of CFR1 on switching the somatic cell fate by RNA-seq and yeast two-hybrid analysis, which will provide a new idea for analyzing the acquirement of plant cell totipotentcy during the process of tissue culture.

在植物的离体再生体系中，植物体细胞能逆转已分化的细胞状态经过脱分化和再分化形成完整的植株。在内外在因素的影响下，体细胞在这个过程中发生命运的转变。然而迄今为止，关于再生体系中体细胞命运转变的分子机理仍不清楚。为了寻找参与这个过程的重要基因，我们从以拟南芥愈伤形成缺陷突变体slr为背景的EMS诱变群体中筛选到一个愈伤形成恢复的突变体cfr1（Callus Formation Related 1）。图位克隆发现CFR1基因发生了一个点突变，pCFR1::CFR1构建完全互补了cfr1突变体的表型。我们拟利用细胞特异标记基因的表达解析其命运转变的细胞学原因；同时，利用GC-TOF等分析CFR1底物或产物对体细胞命运转变的影响；进而通过RNA-seq和酵母双杂确定与其相关的基因，解析CFR1基因突变改变体细胞命运的分子机制。该项目将为研究离体培养中植物细胞全能性的获得机理提供新的思路。

与动物不同，植物已分化的组织、器官能够通过体外培养获得多能性并再生。随着人们对植物再生研究的不断深入及组织培养技术的不断发展，植物离体再生体系已经广泛被应用于分子育种及生物医药等多个领域，而如何提高植物再生效率仍旧是目前亟需解决的问题。愈伤形成是植物再生的关键，近期研究表明，生长素诱导的愈伤组织起源于中柱鞘细胞或类中柱鞘细胞（pericycle-like cells），这些细胞经过根发育过程形成愈伤，然而，调控中柱鞘细胞形成愈伤的分子机制仍不清楚。.我们发现了超长链脂肪酸（very-long-chain fatty acids, VLCFAs）通过限制中柱鞘细胞的愈伤形成能力参与抑制植物再生过程。通过对拟南芥根部愈伤组织形成能力缺陷的indole-3-acetic acid inducible 14/solitary-root（iaa14/slr）突变体进行EMS诱变及遗传筛选，我们获得了一个能够恢复愈伤形成的突变体并命名为callus-formation related 1（cfr1）。cfr1不仅能够特异地恢复slr的愈伤形成及细胞分生能力，而且表现出中柱鞘细胞分生能力增强的表型。基因克隆及遗传互补等实验表明，cfr1愈伤形成能力增强的相关表型是由于参与超长链脂肪酸合成的3-酮脂酰辅酶A合酶1（3-ketoacyl-CoA synthase 1，KCS1）功能缺失所造成的。KCS1主要表达于拟南芥根成熟区的内皮层细胞、侧根原基及新形成的侧根等部位。生化分析结果表明，kcs1突变后导致植株根部饱和超长链脂肪酸的相对含量明显降低，仅为对照的30-60%左右。在超长链脂肪酸合成缺陷的突变体中，外植体的愈伤形成能力增强，而外施超长链脂肪酸则能够抑制kcs1的愈伤形成能力，表明超长链脂肪酸限制中柱鞘细胞形成愈伤的细胞分生能力。基因表达及遗传分析显示，超长链脂肪酸通过抑制细胞分生能力控制因子aberrent lateral root formation（ALF4）的表达而限制中柱鞘细胞形成愈伤。此外，在皮层特异表达KCS1能够互补kcs1愈伤形成能力增强的表型，表明超长链脂肪酸或其衍生物可能作为细胞层特异的信号分子参与调控中柱鞘细胞形成愈伤的细胞分生能力。综上所述，我们的研究揭示了超长链脂肪酸或其衍生物作为信号分子参与限制中柱鞘细胞形成愈伤的细胞分生能力，进而抑制植物体形成