上游远端DNA序列调控c-myb基因转录的作用机制研究

The transcription factor c-Myb is an important regulator of cellular processes such as proliferation, differentiation and apoptosis, and increasing studies suggest that upstream distal elements play essential roles in regulation of c-myb expression, but the detailed mechanisms still remain unclear. Previously, we showed that three upstream regions, located approximately 25、50 and 70kb from the c-myb promoter, interact with the c-myb promoter through DNA-looping in mouse monoblast M1 cells, and regulate c-myb expression with binding of Hoxa9 and PU.1. Further study showed the existence of distal regulatory elements in the upstream regions of c-myb gene in human K562,U937,HL60 cells, suggesting the roles of distal elements in regulation of c-myb in human cells. The present project aims to investigate the detailed mechanisms how distal elements regulate c-myb expression and its role in the genesis of leukemia.

转录因子c-Myb在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥着重要作用，有多项研究证明远端调控元件在c-myb表达调控中具有非常重要的作用，但其详细机制尚不明了。我们前期研究发现小鼠骨髓M1细胞c-myb启动子上游25kb、50kb、70kb三个区域的DNA元件与c-myb启动子相互作用，转录因子Hoxa9、PU.1等可以通过结合这些远端元件调控c-myb的转录。进一步我们在人白血病细胞系K562、U937、HL60中也发现c-myb上游DNA调控元件与启动子长距离作用的存在，说明人c-myb基因也受到远端调控元件的调控。本项目将在此基础上对于c-myb上游远端调控元件的作用机制进行详细的研究，在鉴定出增强子等元件的基础上探索转录因子和表观遗传学修饰在其中的作用机制，并验证这些机制在人白血病发生中的作用。

转录因子c-myb（MYB）在细胞增殖分化、凋亡等过程中具有重要作用，和白血病的发生密切相关，前期研究证明远端调控元件在MYB表达中具有重要调控作用，但详细机制尚不明了。本项目首先利用环状染色质构象捕获（4C）技术在人白血病细胞系K562、U937、HL-60中发现了MYB上游-34k、-88k区域与启动子的相互作用，双荧光报告系统分析发现上述远端序列具有增强子活性，ChIP-seq数据库显示这些区域有H3K27ac富集和转录因子（GATA1、TAL1、C/EBPβ、c-Jun、PU.1）结合。K562、U937、HL-60细胞诱导分化后这些上游区域和MYB启动子相互作用、H3K27ac水平均会降低，同时转录因子结合也发生上升或下降，说明-34k、-88k区域存在调控MYB表达的增强子元件。进一步研究发现通过dCas9-p300、dCas9-Dnmt3a靶向改变-34k、-88k区的H3K27ac和DNA甲基化水平后，MYB表达和转录因子结合均发生了变化，证明表观修饰影响了增强子处的转录因子结合和转录激活活性（数据已发表）。前期4C数据和转录组数据分析发现MYB上下游多个区域具有转录活性，通过RACE技术克隆出-34k-lncRNA、-34k+lncRNA、-96klncRNA和+140klncRNA等多个lncRNA，其中-96k、-34k-lncRNA和-34k+lncRNA的水平与MYB表达呈正相关。核质分离实验显示这些 lncRNAs 主要分布于细胞核。K562细胞中-34k-lncRNA、-34k+lncRNA和-96klncRNA的过表达均促进 MYB 表达、细胞增殖、迁移和细胞周期。-34k-lncRNA 和-34k+lncRNA 能促进 -34k 增强子与 启动子的相互作用。RNA Pull-Down 联合质谱分析结果结合RIP-qPCR 显示--34k-lncRNA 与 NONO 、14-3-3 ε/γ（YWHAE/YWHAG）蛋白结合，-34k+lncRNA与组蛋白H3和H3.3相互作用。 RNA-seq 分析显示-34k-lncRNA 过表达后导致 MYB 第一外显子出现显著性选择性剪接差异。本项目将为深入理解MYB表达调控机制和相关疾病治疗提供坚实的基础。