大豆和本氏烟中抗疫霉关键转录因子的筛选与功能验证

Disease resistance genes and pathogen-inducible promoters are important to plant disease resistance. We have identified three Phytophthora sojae induced promoters in soybean and established a scientific method of promoter inducibility analysis in Nicotiana benthamiana, also established soybean hairy root transformation and gene silencing system in soybean cotyledons. Here, we designed a new and efficient transcription factors screening protocol. First, the transcriptors expression profiles of N. benthamiana-P. parasitica interactions at transcriptome level will be analyzed by RNA-seq and qRT-PCR. We will screen up-regulated transcriptors which regulate the three P. sojae induced promoters and determine its Phytophthora resistance by VIGS approach. Second, the soybean transcriptors were got by nucleotide and amino acid sequence homological comparison, and the Phytophthora resistances were verified in soybean. Third, the regulatory mechanism of transcriptors and pathogen-inducible promoters will be analyzed by Yeast one-hybrid. We will establish a system of new and efficient transcription factors screening protocol, and provide the experimental method and experimental scheme to the related research; we also will get 2-3 key conferring Phytophthora resistance transcriptors in soybean and N. benthamiana, which are important to plant disease resistance breeding; The results will aid the understanding of the mechanisms of P. sojae-induced promoters and key Phytophthora resistance transcription factors.

在植物抗疫霉基因工程中需要有效的抗病功能基因和病原诱导性启动子。前期在大豆中已获得了3个疫霉诱导性启动子，并在本氏烟上建立了高效启动子病原菌诱导活性分析技术，在大豆上建立了大豆子叶转化及瞬时沉默体系，本项目新设计了一套简便、快速、有效的植物抗疫霉关键转录因子筛选、功能研究方案。基于本氏烟与疫霉互作转录组数据，利用VIGS技术、启动子诱导活性分析技术，获得调控启动子诱导活性的转录因子，分析其抗疫霉功能；通过基因同源比对获得大豆中相关基因，利用大豆子叶转化及瞬时沉默技术，验证其在大豆中的抗疫霉功能。用酵母单杂交技术揭示转录因子对已知启动子的调控机制。项目的实施将建立一套有效的植物抗病关键转录因子筛选技术体系，为相关研究提供实验思路和技术方案；从大豆和烟草中获得抗疫霉关键转录因子为植物抗疫霉分子育种提供有应用潜力的功能基因；阐明转录因子介导的植物抗病机理和已知疫霉诱导性启动子作用的分子机制。

我们利用本氏烟与寄生疫霉互作系统，探讨了转录因子在植物-疫霉互作中的作用。旨在通过本项目的开展为植物的抗疫霉基因工程提供思路和资源。经过三年的努力，我们取得了如下研究进展：.1. 比较分析了寄生疫霉Pp025侵染本氏烟6 h与0 h的转录组数据中基因表达情况，发现有14179个差异表达基因，包括5965个上调表达基因，8214个下调表达基因。这些 DEGs 涉及光合作用、淀粉合成、氮素同化、糖讲解、JA和ETH信号通路基因、抗病相关基因、受体激酶和转录因子等功能。.2. 系统分析了本氏烟中抗疫霉相关差异表达转录因子，并筛选和鉴定了其中对本氏烟疫霉抗性具有显著正调控作用的WRKY和ERF转录家族，以及一个具主效负调控作用的DBB转录因子家族，可能参与调控本氏烟的抗疫霉特性。.3. 研究了本氏烟NbERF1转录因子的抗病功能。过表达NbERF1可以增强本氏烟对寄生疫霉的抗性，而沉默该转录因子显著降低其抗性，表明NbERF1正调控本氏烟对疫霉菌的抗性。结合NbERF1沉默后的植株进行的RNA-Seq分析，酵母单杂交技术验证了NbERF1通过结合RLK基因启动子区的 GCC-box，调节下游 RLKs 基因的表达，增强本氏烟对寄生疫霉的抗性。.4. 本氏烟NbERF173抗病过程功能分析。过表达NbERF173可以增强本氏烟对寄生疫霉的抗性，而沉默该转录因子显著降低本氏烟对寄生疫霉和灰葡霉菌的抗性。利用RNA-Seq技术分析寄生疫霉菌侵染NbERF173沉默的本氏烟叶片，并结合酵母单杂交技术，以及抗病性试验证明NbERF173间接调控2个蛋白酶抑制子基因，而这两个基因正调控本氏烟的抗病性。.5. 本氏烟NbMYB57转录因子的抗病功能研究。过表达NbMYB57可以增强本氏烟对寄生疫霉的抗性，而沉默该转录因子显著降低本氏烟对寄生疫霉和灰葡霉菌的抗性。结合RNA-Seq分析、ChIP-Seq分析和酵母单杂交文库的筛选，鉴定NbMYB57 可能调控的下游靶标基因。发现茉莉酸信号通路中的调控因子JAZ3，WRKY转录因子和bHLH转录因子，可能是NbMYB57调控的靶标基因。