microRNA-异常激素受体-cAMP信号通路反馈性调控网络在ACTH-非依赖性肾上腺大结节增生发病过程中的功能研究

ACTH非依赖性肾上腺大结节增生（AIMAH）表现为代谢紊乱及一些继发性病变，如高血压、糖尿病等。发病机制不明确，手术是主要治疗手段。针对AIMAH的发病机制研究集中在肾上腺激素受体的异位ACTH非依赖性肾上或异常表达，但异常激素受体表达的机制不明确。microRNA作为一种调控性非编码RNA，在生命活动中的功能近年来备受重视，而在内分泌调控中的作用是目前研究热点之一。cAMP信号通路中所涉及的转录因子表达异常也是AIMAH分子水平的改变之一。本课题组前期工作发现AIMAH组织中microRNA存在特异的表达谱，与多种激素受体表达异常存在密切关系。本项目拟以特异microRNA对受体表达的调控以及cAMP信号通路相关转录因子对microRNA的调控为切入点，研究DNA、RNA、蛋白质等三个不同的信息层之间的相互作用，构建AIMAH发生过程中的调控网络，从全新的角度阐释AIMAH的发病机制。

课题主要解决了以下问题：(1)揭示AIMAH组织具有特异的miRNAs表达谱， qRT-PCR方法验证miRNA芯片结果。在31个上调的miRNAs中有6个最为明显（hsa-miR-663、 hsa-miR-557， hsa-miR-585， hsa-miR-498， miR-638， miR-654-5p），在下调的25个miRNAs有5个最为明显（hsa-miR-744， hsa-miR-565， hsa-miR-886-3p， hsa-miR-143， hsa-miR-886-5p）。这些异常表达的miRNAs可能参与该疾病表型的调控。(2)研究特异表达miRNAs的功能及分子机制。在肾上腺皮质癌细胞SW13中干预上述特异表达的miRNAs，利用CCK-8方法检测细胞增殖的变化。抑制miR-663, miR-557, miR-585等miRNAs的表达，细胞增殖明显受到抑制；而利用miRNA mimic（miR-744, hsa-miR-143）在SW13细胞中完成过表达，细胞增殖同样被明显抑制。miRNAs进行靶基因预测并证实在AIMAH中存在miR-663-JunB/JunD，miR-557-CDKN1C/ESRRG，miR-498-CREBL2/CRH，miR-744-JunB的作用，并参与AIMAH的发生。(3)研究CREB介导的miRNA转录调控在AIMAH中的分子机制。利用生物信息学分析了AIMAH发生相关miRNAs的表达调控序列，通过预测可能的转录因子结合位点，鉴定CREB所参与调控的miRNA（miR-557，miR-663）；利用CREB特异siRNA (si-CREB)研究该转录因子对miR-557，miR-663等miRNAs的调控。(4)揭示AIMAH具有遗传倾向性。临床研究发现本病具有家族聚集发病现象，系统筛查29个家庭，270名成员，发现家族性发病者占66%。家系图谱分析显示符合常染色体显性遗传模式，完成初步的遗传分析和全外显子组测序，并已发现60多种基因可能与本病有关。本研究系统研究了AIMAH发生相关miRNAs的表达及功能，并揭示了特异miRNAs表达调控相关的转录因子及其靶基因组成的信号通路与AIMAH表型之间的关系，完成了课题设计的研究内容，遗传学研究为揭示AIMAH的miRNA及受体异常表达的上游病因提供新的研究方向。