细胞旁路氯离子通道在Gordon综合征中的作用及机制研究

Gordon's syndrome is a rare monogenetic form of hypertension. Despite recent advances establishing the role of transcellular channels as underlying mechanism for Gordon's syndrome, whether changes in paracellular permeability may also contribute to its pathogenesis remains unknown. The importance of paracellular chloride transport in blood pressure regulation has been demonstrated by us in a series of papers describing the potential role of CLDN4 and CLDN8 in causing hypertensive disorders. In vitro analysis revealed that human mutations in the Gordon's syndrome genes may directly regulate the paracellular pathway in the kidney. This proposal will study how WNK4 mutation (D561A) and conditional deletion of KLHL3 in mouse models may affect paracellular permeability in the distal nephron and explore if deletion of CLDN4 or CLDN8 in WNK4 (D561A) background will reduce the paracellular chloride reabsorption and ameliorate the abnormal ion homeostasis and hypertensive phenotype. Molecular, biochemical and electrophysiological approaches are being used to study the molecular mechanisms involved in the regulation of paracellular chloride permeability. We reckon that results collected from this grant proposal may reveal novel mechanisms that will aid the development of new anti-hypertension drugs based upon correcting TJ permeation defects.

Gordon综合征是一种罕见的单基因遗传性高血压，相对于离子跨细胞转运途径在Gordon综合征发病机制中的研究，细胞旁路转运途径的作用尚未明确。本课题组的一系列研究证实，远端肾单位由紧密连接蛋白CLDN4和CLDN8介导的细胞旁路氯离子重吸收是血压调控的重要机制，体外数据显示Gordon综合征致病基因突变体可过度激活细胞旁路氯离子转运，提示细胞旁路氯离子通道在Gordon综合征中扮演着重要的角色。本项目拟运用分子、生化及电生理技术，在细胞和动物模型上研究Gordon综合征致病基因突变体WNK4(D561A)及KLHL3缺失导致的细胞旁路氯离子通道的功能表达变化及分子机制，并探讨特异性抑制细胞旁路氯离子通道能否改善Gordon综合征的血压及代谢异常。通过上述研究，进一步揭示Gordon综合征的发病机制，并将有助于探索紧密连接作为高血压潜在治疗靶标的可能性。

Gordon综合征是高血钾、低肾素型单基因遗传性高血压，又名家族性高血钾性高血压或假性醛固酮减少症二型。Gordon综合征有4个致病基因己被证实，其中两个基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine-threonine Kinases with No Lysine Kinase，WNKs）WNK1与WNK4，另外两个基因编码 Cullin-Ring Ligase (CRL) E3泛素连接酶复合体的两种重要组成蛋白Kelch-like 3 (KLHL3) 和Cullin 3 (CUL3)，这些特定的基因变异通过复杂的级联信号通路，改变了多种离子转运蛋白的功能。相对于离子跨细胞转运途径异常在Gordon综合征发病机制中的研究，细胞旁路转运途径到的关注较少。本项目基于我们前期体外实验数据基础上，利用多基因转入及敲除小鼠模型证实了连接小管/集合管细胞旁路氯离子转运异常是导致Gordon综合征高血压和离子代谢异常的重要机制。Gordon综合征致病基因WNK4可通过调控CLND4磷酸化，进而调控其细胞膜定位及与ZO1的相互作用而调控细胞旁路氯离子通透性。KLHL3可通过调控CLDN8泛素化降解，调控肾脏连接小管/集合管细胞旁路氯离子重吸收。通过多基因修饰小鼠模型，我们发现连接小管/集合管组织特异性CLDN4或CLDN8缺失均可改善Gordon综合征模型WNK4D561A基因敲入小鼠的高血压和离子代谢异常。本项目对进一步揭示Gordon综合征的发生机制及发现新的高血压潜在治疗靶标具有非常重要的理论意义和实际应用价值。本项目在解析其他紧密连接分子是否参与Gordon综合征血压调控时发现一个极为有趣的现象，与两细胞间紧密连接蛋白CLDN的膜分布不同，三细胞间紧密连接蛋白Angulin-1（LSR）表达于肾脏上皮细胞的细胞核内。目前关于LSR在肾脏的表达情况、亚细胞定位及调节机制均不清楚，我们在C57BL/6J背景构建了Lsr loxP小鼠，并与近端小管细胞特异性Cre转基因小鼠Ggt1-cre杂交，获得近端小管特异性Lsr基因缺失小鼠，解析了在急性肾损伤与慢性肾脏病过程中，LSR在近端小管损伤和纤维化中的作用与机制，近端小管LSR缺失可保护单侧肾缺血诱导的急性肾损伤和慢性肾脏病。