压力应激下RGC细胞内Aβ蛋白的产生及其损伤机制

相关文献报道及我们的前期研究已经证实：Aβ蛋白是压力应激导致视网膜神经节细胞（RGC）凋亡的重要因子，但是其分子机制尚未明确。为了探讨Aβ在压力应激下RGC内的产生及损伤机制，本项目拟采用智能控制静水压系统培养RGC-5细胞以诱导Aβ过量表达，从而利用免疫共沉淀与免疫印迹分析Aβ在细胞内的产生与主要存在形式；然后在体内外分别检测（体内用APPswe/PS1deltaE9转基因小鼠-高眼压模型，体外用RGC-5细胞）Aβ与内质网、高尔基体、溶酶体等细胞亚单位的共定位，以明确Aβ在细胞内的代谢途径；最后通过下调（RNA干扰Aβ分泌酶）与上调（静水压诱导分泌）试验分别检测Aβ对于内质网应激、氧化应激、线粒体功能和细胞内Ca2+水平等细胞损伤指标的影响，以期阐明Aβ在RGC压力应激中的主要损伤机制。通过本课题研究，有望为探索视网膜RGC保护的新靶点提供实验依据与理论基础。

在国家自然科学基金的资助下，本项目探讨了压力应激等条件下视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGC）细胞内β淀粉样蛋白(Amyloid Beta, Aβ)蛋白的产生及其损伤机制：1. 静水压力应激、缺氧损伤可诱导RGC细胞内β淀粉样蛋白前体蛋白（Amyloid precursor protein, APP）异常酶切，并导致具有神经毒性的Aβ蛋白过表达；2.在智能控制培养系统内的低氧、静水压微环境中RGC细胞的凋亡与Aβ产生有关；3.在智能控制培养系统诱导的低氧、静水压微环境中RGC细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)释放增加，线粒体膜电位降低，表现为细胞氧化应激反应；4.氧化应激诱导RGC细胞内的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放增加，MTP-131可以部分逆转氧化应激引起的LDH释放，且成剂量依赖性；5.氧化应激导致RGC细胞线粒体去极化，MTP-131可以部分逆转该病理过程；氧化应激导致RGC细胞内ROS增加，MTP-131可以降低ROS的释放增加。6. 压力应激诱导RGC细胞内质网应激反应激活。内质网应激可以直接导致RGC细胞内APP代谢酶BACE1和PS1表达水平变化，APP酶切、Aβ蛋白产生增加；7. 内质网应激损伤过程中Aβ蛋白的代谢关键酶Neprilysin、ECE1、 ECE2没有活性变化，说明Aβ蛋白的生成主要是通过酶切增加产生；8. 内质网应激损伤过程中同时伴有caspase-3/CHOP细胞凋亡信号启动。相关研究结果已经发表SCI论文3篇，参与国际会议（ARVO2013，Seattle）论文展示1次，另有SCI论文1篇回修中，本项目所用的智能控制压力培养系统已经申请发明专利1项(专利号201210379087.9 )，已授权。