烟碱类杀虫剂噬菌体展示多肽竞争物作用机制与定量构效关系研究

Currently, immunoassay is one of important focuses in the study and development of pesticide screening technology. Phage display technology provides a way for rapid preparing heterologous competitor and enriching detection mode. But the mechanism of action of phage display competitor is undefined, and lacks the method of structure optimization, limit preparation of high quality phage display polypeptide competitor. This project based on previous research work of neonicotinoid insecticide immunoassays, and combines the theory and application study of phage display peptide and computer-assisted molecular modeling technique, the quantitative structure-activity relationship and mechanism of phage display polypeptide competitor for neonicotinoid insecticides will be study. For detail, imidaclothiz, thiacloprid, and clothianidin are selected as the typical object, establishing phage peptide library; obtaining phage display polypeptide competitor by affinity panning; confirming the core amino acids of the phage display polypeptide competitor and the reaction between the phage display polypeptide competitor and antibody; building a quantitative structure-activity relationship between the peptide residue side chain and the sensitivity; ultimately, preparing high quality peptides competitor and validating. Through carrying out this project, the theoretical basis for the application of phage display polypeptide competitor in neonicotinoid insecticide immunoassays will be established, and the mechanism of phage display polypeptide competitor will be provided.

免疫检测技术是当前重点研究和开发的农药筛查技术之一。噬菌体展示技术为快速制备异源竞争物、丰富检测模式等提供了途径，但农药噬菌体展示多肽竞争物作用机制不明确，结构优化方法缺乏，限制了高质量噬菌体展示多肽竞争物的制备。本项目在前期烟碱类杀虫剂免疫检测技术的研究工作基础上，结合噬菌体展示和计算机辅助分子模拟技术的理论和应用研究，开展烟碱类杀虫剂噬菌体展示多肽竞争物作用机制与定量构效关系的研究。拟选定氯噻啉、噻虫啉、噻虫胺三种烟碱类杀虫剂为典型对象，通过建立噬菌体展示多肽库；亲和淘选获得噬菌体展示多肽竞争物；确定噬菌体展示多肽竞争物的核心氨基酸及其与抗体的作用方式；构建多肽残基侧链与敏感性之间的定量构效关系；最终制备高质量烟碱类杀虫剂多肽竞争物，并进行验证。通过本项目的开展，将为噬菌体展示多肽竞争物在烟碱类杀虫剂免疫检测中的应用奠定理论基础；为噬菌体展示多肽竞争物的结构优化提供途径。

制备了氯噻啉、噻虫啉、噻虫胺、吡虫啉、苯噻菌酯、有机磷类农药等单克隆抗体，从噬菌体展示多肽库中淘选获得了氯噻啉、噻虫啉、吡虫啉和苯噻菌酯的噬菌体展示多肽竞争物，以及抗苯噻菌酯噬菌体展示多肽免疫复合体。建立了竞争噬菌体酶联免疫吸附分析方法（ELISA）、竞争噬菌体化学发光酶联免疫分析方法和非竞争噬菌体酶联免疫吸附分析方法等，其敏感性比基于化学合成包被抗原建立的ELSIA提高了2至120倍，并且化学发光酶联免疫分析方法具有更宽的检测范围，非竞争具有更强的特异性。利用计算机辅助模拟研究了有机磷农药类特异性抗体与噬菌体展示多肽竞争物之间的互作机制，结果表明多肽竞争物中的Pro8结合在抗体Tyr34、Tyr51、Trp48、Tyr108、Phe109构成的疏水腔中，并与上述残基存在疏水作用。根据作用机制研究的结果，设计并构建了15种突变体，通过噬菌体ELISA的验证，其中3个突变体的敏感性优于母体。将氯噻啉噬菌体展示多肽竞争物与纳米荧光素酶进行融合表达，首次制备了单价重组多肽竞争物，并建立了生物发光免疫吸附分析和生物发光侧流层析分析方法。针对生物发光侧流层析方法设计了一套配合智能手机的检测装置，可通过手机拍照实现试纸条对农药残留的定量检测，且不需要外源激发光源。合成了发光效率高的六角相上转换纳米材料NaYF4,Yb3+,Er3+，并对其进行氨基功能化。利用上转换纳米材料、量子点和镧系元素等，建立了基于内滤效应的上转换荧光免疫分析方法、上转换荧光磁分离快速检测方法、上转换荧光免疫层析分析方法、量子点荧光免疫分析方法和时间分辨荧光免疫分析方法等。.相关研究促进了噬菌体展示多肽技术在农药残留快速检测中的应用，为农药噬菌体展示多肽竞争物的研制及应用提供了理论指导和借鉴。研究结果发表了7篇SCI论文，其中第1标注6篇，综述1篇；申请发明专利4项，授权2项。