基于HPLC-CYP2A6 EAD-MS联用新技术的尼古丁成瘾戒断活性成分快速发现研究

对中枢神经的刺激诱导尼古丁依赖是吸烟者成瘾而难于戒烟的主要原因。尼古丁主要被CYP2A6代谢，使血液浓度降低，因此通过抑制CYP2A6活性可提高尼古丁生物利用度，干预吸烟依赖行为。在活性筛选中，我们发现某些中药特别是蛇床子等具有较强CYP2A6抑制活性，而中药复杂体系中活性成分的快速发现与研究一直是中药研究的热点和难点问题。因此，本项目拟建立快速高通量识别复杂体系中CYP2A6抑制剂的联用新技术：HPLC-CYP2A6 EAD-MS，系统研究中药提取物中的活性成分，并采用HSCCC导向制备单体化合物，建立一套基于HPLC-CYP2A6 EAD-MS/HSCCC技术的中药复杂体系中CYP2A6抑制剂的快速筛选和制备方法。应用现代光谱学方法与化学方法鉴定结构，同时进行系统的体外活性筛选和构效关系分析，以期发现新型的CYP2A6抑制剂，寻找具有潜在开发价值的戒烟新药，促进我国创新药物的发展。

尼古丁的体内主要代谢酶CYP2A6酶活性的缺失对于吸烟习惯的形成以及戒烟难易程度有着重要的影响, 通过使用CYP2A6酶抑止剂可减缓尼古丁的体内代谢速度，降低吸烟的欲望。本项目筛选了240多种天然药物提取物对CYP2A6的抑制活性，从中选择抑制活性较强的蛇床子进行系统研究。接着建立一维和二维HPLC(SEC×RP)系统分析中药复杂体系中不同极性、不同含量的组分；设计和构建离子对色谱-质谱联用新技术分析强极性组分。构建CYP2A6 EAD流动注射分析体系，考察反应温度和pH值、甲醇含量、酶和反应底物的含量、反应线圈体积等对体系稳定性和准确性的影响，优化最佳条件；接着将优化的CYP2A6 EAD流动注射分析系统与HPLC-MS联用，建立HPLC-CYP2A6 EAD-MS在线联用技术，并将该联用技术应用于研究蛇床子的生物指纹图谱，以达到快速筛选和识别蛇床子中CYP2A6抑制活性组分的目的。通过分析UV和MS数据确定蛇床子中5个香豆素类化合物(花椒毒酚，异茴芹素，佛手柑内酯，欧前胡素和蛇床子素)具CYP2A6抑制活性。使用制备HPLC结合多种逆流色谱技术(如梯度洗脱和循环逆流色谱等)分离富集目标组分用于NMR检测和药理筛选。药理筛选表明花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素和蛇床子素在浓度为30 μmol/l时，对CYP2A6抑制尼古丁代谢的抑制率分别为：30.5%，31.8%，31.3%，64.8%和40.9%，且呈剂量依赖性抑制。该研究建立一套基于HPLC-CYP2A6 EAD-MS/HSCCC技术的中药复杂体系中CYP2A6抑制剂的快速筛选和制备方法。在该项目经费的资助下，发表SCI论文18篇，授权发明专利1项。培养2名博士研究生和3名硕士研究生，为天然产物活性成分快速筛选研究积累人才。已圆满打完成项目计划书的研究任务，达到预期成果。