外周血Exosomes中lncRNA表达谱分析在膀胱癌转移诊断中的应用价值分析

The incidence of bladder cancer ranks first in the urological tumor. Cancer metastasis is the leading cause of tumor related deaths in patients with bladder cancer. The early diagnosis of metastatic bladder cancer can help guide clinical treatment, which is restricted to the lack of specific indicators. LncRNA is recognized to be involved in the cancer metastasis, which is promising in the diagnosis of metastatic bladder cancer. However, lncRNA is easy to be degraded in peripheral blood. Exosomes are small vesicles secreted by cells in which LncRNAs are encapsulated, and thus to protect LncRNAs from degradation. The expression profile of lncRNA in exosomes of bladder cancer patients was correlated to that in bladder cancer tissues, both were significantly different from the lncRNA expression in the paraneoplastic tissues. In the current study, we want to obtain the circulating exosomal lncRNA expression profile via high throughput lncRNA microarray using a large number of bladder cancer specimens, which can be used for the early diagnosis of metastatic bladder cancer. Furthermore, in vivo and in vitro experiments are designed to verify the role of these lncRNAs in regulating bladder cancer metastasis, and ChIRP-Seq, ChIRP-MS and other techniques will be applied to identify the target protein/target gene and further reveal the underlying mechanism. This study will provide new promising indicators for the early diagnosis and treatment of bladder cancer metastasis.

膀胱癌发病率位居泌尿系统肿瘤首位，肿瘤转移是造成其死亡的主要原因，实现膀胱癌转移的早期诊断有助于指导临床治疗，但目前缺乏特异性指标。研究发现，lncRNA参与调控肿瘤细胞的侵袭转移，有望用于膀胱癌转移的诊断，但其游离在血液中易降解；Exosomes是细胞分泌的微小囊泡，lncRNA可“储藏”其中从而在外周血中保持稳定。我们前期通过lncRNA芯片发现，膀胱癌患者外周血Exosomes中lncRNA表达与肿瘤组织中基本一致，两者均与癌旁组织存在显著差异。本课题拟利用lncRNA芯片技术，通过膀胱癌临床标本系统分析获得可用于其转移早期诊断的外周血Exosomes中lncRNA表达谱型；进一步通过体内外实验证实这些lncRNAs对膀胱癌转移的调控作用，并借助ChIRP-Seq、ChIRP-MS等技术筛选其直接作用的靶基因和靶蛋白，明确其作用机制。研究结果可望为膀胱癌转移的早期诊治提供全新指标。

在国家自然科学基金经费资助下，课题组基本按原课题计划书顺利完成本项目研究。首先我们使用芯片分析正常人、未发生转移的膀胱癌患者和发生转移的膀胱癌患者外周血Exosomes 中的表达，并筛选出一批差异明显lncRNA，但后期实验实施过程中发现，收集大量的临床患者外周血标本以及提取大量标本外周血Exosomes存在一定的难度，Exosomes提取质量欠佳，提取成本高，鉴于经费原因，我们只做了少量标本，并选择其中存在明显差异表达的lncRNAs，检测它们在膀胱癌肿瘤组织和癌旁组织中的表达量，发现lncRNA HOXA-AS3(HOXA-AS3)在肿瘤组织尤其是后续随访发生转移的膀胱癌组织中显著增高，因此对HOXA-AS3进行了更深入的研究，但我们发现HOXA-AS3并不会直接参与调控膀胱癌细胞的侵袭转移，考虑到化疗耐药在膀胱癌后期发生转移中的重要作用，我们考虑可能lnc HOXA-AS3可能参与膀胱癌的化疗耐药。接下来进一步的研究结果发现抑制 HOXA-AS3可以通过调节膀胱癌细胞系中的 EMT 和 Notch1的表达来增强缺氧诱导的顺铂敏感性。双荧光素酶报告基因检测证实 HOXA-AS3 直接靶向 miR-455-5p，而Notch1 又是 miRNA-455-5p 的潜在靶标。最后我们发现在 BALB/c nu/nu 小鼠模型中将 HOXA-AS3 siRNA 与顺铂治疗相结合可以显著的抑制了肿瘤发生。综上研究果表明，HOXA-AS3 可能作为 miR-455-5p 的竞争性内源 RNA (ceRNA) 来调节 Notch1，并在调节膀胱癌细胞系的化疗药物敏感性中发挥重要作用。因此，HOXA-AS3可能成为治疗膀胱癌的新靶点。研究结果在肿瘤领域的高分期刊Front Oncol发表SCI论文一篇。