重组钙网蛋白用于抗肿瘤免疫治疗的实验研究

钙网蛋白（CRT）是新近发现能介导凋亡细胞清除的细胞膜蛋白。某些刺激引起细胞凋亡时，CRT从细胞内向细胞膜大量转移并在膜上聚集成簇。作为一种特异性配体，CRT与吞噬细胞膜上的相关受体相互作用并激活后者的吞噬功能，由此构成针对凋亡细胞特异性清除的信号系统。近期研究进一步发现，CRT若出现在凋亡的肿瘤细胞膜上，该肿瘤细胞可被树突状细胞（DC）识别和吞噬，肿瘤相关抗原在DC细胞内加工和提呈，从而导致机体产生针对该肿瘤的免疫杀伤效应，提示CRT在肿瘤免疫预防和治疗中的重要潜在应用价值。本研究旨在利用基因工程技术，将CRT蛋白大量包被到肿瘤细胞表面，包被CRT的肿瘤细胞经凋亡处理后，用作一种肿瘤抗原细胞免疫实验动物，以期在动物体内诱导出针对同种肿瘤的免疫杀伤效应，从而达到预防和治疗特异性肿瘤的目的。本项目如能证实上述方法在介导抗肿瘤免疫过程中的有效性，将为肿瘤的免疫治疗和预防提供新的思路和途径。

肿瘤细胞在特定条件下发生凋亡时（如蒽环类药物处理），位于内质网中的钙网蛋白（CRT）可向细胞膜表面大量转移并在膜上簇集，膜上的CRT能介导肿瘤细胞被包括DC细胞在内的抗原提呈细胞识别和吞噬，由此激发机体产生抗肿瘤免疫活性。但CRT从细胞内向细胞膜转移并非所有凋亡肿瘤细胞的固有特征，而是特定肿瘤细胞在特定凋亡刺激下发生的分子改变，研发对各种肿瘤细胞都能进行有效CRT包被的方法和途径，将为肿瘤免疫治疗的基础研究和临床应用提供有力工具。.本项目以小鼠黑素瘤为研究对象，综合利用分子生物学研究技术，设计如下三种不同方式将CRT包被到凋亡肿瘤细胞膜上, 然后再用此CRT包被的肿瘤细胞作为疫苗免疫模型动物，以研究它们在激发机体特异性抗肿瘤免疫应答中的功能：（1）克隆获得小鼠CRT的编码序列，将其与病毒G蛋白偶联受体（GPCR）基因重组，重组基因转染小鼠黑素瘤B16-F1细胞后，在细胞内合成CRT-GPCR融合蛋白，由于融合蛋白中的GPCR含有跨膜结构域而高效地结合到肿瘤细胞表面，从而将CRT蛋白大量携带到肿瘤细胞膜上；（2）将小鼠CRT编码序列克隆入原核表达载体并转入E.coli表达菌中，诱导表达后用亲和层析法分离纯化CRT蛋白，然后将此原核表达的CRT蛋白与凋亡的B16-F1细胞共孵育，由此将CRT人工包被到瘤细胞膜上；（3）用蒽环类化疗药物处理B16-F1细胞，该药在诱导瘤细胞发生凋亡的同时，还促使CRT大量从细胞内转移到细胞膜表面。体外分析发现，上述三种方式均能有效地将CRT蛋白包被到肿瘤细胞膜上，并且这些CRT包被的肿瘤细胞能更有效地被DC细胞和巨噬细胞识别和吞噬。将上述三种形式CRT包被的黑素瘤细胞用作细胞疫苗免疫实验小鼠后，在动物体内诱导出高效的抗同种肿瘤的免疫效应，对免疫后再接种黑素瘤活细胞的成瘤率产生显著性抑制。体内免疫活性分析发现，免疫后小鼠的脾细胞中抗肿瘤细胞因子INF-和TNF-α的合成与分泌显著增加，对B16-F1活细胞的免疫杀伤能力增强，但对无关肿瘤细胞则无此影响。提示本项目成功研发的用CRT-GPCR融合蛋白对肿瘤细胞进行基因工程包被和用原核表达的CRT对肿瘤细胞进行人工包被的方法，能使肿瘤细胞发生免疫原性转化。由于这两种方法对其它肿瘤细胞具有普适性，上述研究成果将为CRT介导的新型肿瘤疫苗的研制奠定基础，为临床肿瘤的免疫治疗提供新的途径。