胸腺基质淋巴细胞生成素在角膜免疫反应中的作用及其机制

研究表明角膜上皮不仅作为机械性屏障在抵抗微生物过程中发挥被动的防御作用，还通过分泌细胞因子能动地参与眼表的免疫反应与调节。TSLP是一种新发现的上皮细胞源性因子，对过敏性皮炎和哮喘的发病和维持起重要作用。我们研究发现，在SRW诱导的小鼠过敏性结膜炎模型、小鼠干眼模型和体外细胞感染模型中，角膜组织均高表达TSLP。但是，尚不清楚固有免疫诱导表达的角膜上皮细胞源性TSLP对角膜获得性免疫有何影响。本课题旨在前期研究的基础上，结合Th17的研究进展，对TSLP在人角膜免疫反应中的作用及其机制进行探索：⑴建立体外人角膜上皮细胞感染模型，诱导表达TSLP并探讨其机制；⑵检测人角膜上皮细胞来源的TSLP对DCs的影响；⑶检测TSLP-DCs对CD4+T细胞分化状态的影响，并阐明其机制。揭示人角膜上皮细胞来源的TSLP将角膜固有免疫和获得性免疫联系起来，为感染性角膜疾病的治疗提供新的理论依据和治疗靶点。

目的：本研究拟探讨胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP)在人角膜上皮细胞(HCECs)中的表达及其诱导机制；并进一步探讨TSLP在人眼表免疫反应及免疫调节中的作用。.方法：组织块培养法培养HCECs。分别用化学合成的TLRs1-9的配体刺激HCECs，并检测TSLP的表达变化。分别用因子相关抗体、NFκB抑制剂、siRNA-TRIF及siRNA-MyD88作用于HCECs，观察TSLP的表达变化以及IRF3和NFκB活性的变化。利用免疫磁珠分选技术分离培养CD11c+DCs和CD4+T细胞，将polyI:C作用HCECs的条件培养上清用于体外诱导iDCs，观察其表面分子CD80、CD86、CD83的表达变化，并将其与CD4+T细胞共培养，测定Th细胞分化相关因子的表达，并检测转录因子的表达变化。.结果：TLRs3、5和6的配体polyI:C、flagellin和FSL-1可以显著的提高TSLP基因和蛋白水平的表达，其变化存在浓度依赖模式。TLR3的中和抗体或NFkB-I可以显著抑制polyI:C刺激HCECs所引起的TSLP 的表达。此外，转染siRNA-TRIF也可以抑制polyI:C刺激所引起的TSLP的产生。PolyI:C刺激4小时的HCECs中NF-kB p65活化，并且IRF3的活性显著提高，而TLR3的中和抗体或NFkB-I可以抑制上述反应。PolyI:C作用角膜上皮细胞得到的培养上清可以诱导iDC表面表达CD80、CD83和CD86，这种效应可以被TSLP的抗体所抑制。PolyI:C-DCs和CD4+T细胞共培养可以诱导Th2细胞因子（IL-13、IL-10和TNF-α）以及Th17细胞因子（IL-17和IL-22）表达上调，而Th1细胞相关因子IFN-γ表达没有显著性变化。同时， Th2细胞分化相关基因GATA3以及Th17细胞分化相关基因SATA3和转录因子RORγt表达也相应增加。.结论： TLR3的配体poly:IC 、TLR5的配体flagellin和TLR6的配体FSL-1均可刺激HCECs中TSLP的产生。PolyI:C可能通过TLR3/TRIF/IRF3/NFκB信号通路诱导HCECs表达TSLP。人角膜上皮来源的TSLP可以诱导iDC成熟分化，并进一步诱导CD4+T细胞向Th2细胞和Th17细胞分化。