hsa-miR-20调控肝癌辐射敏感性的分子机制研究

Hepatocellular carcinoma accounts second cancer related death in china. Most primary hepatocarcinoma patients receive radiotherapy and/or interventional therapy, while hepatocarcinoma is not radiosensitive. Therefore, it is critical to improve radiosensitivity of hepatocarcinoma. We have reported that deficient of a cancer suppressor gene, PTEN, in hepatocarcinoma tissue/cells. Upregulation of PTEN increased radiosensitivity of hepatocarcinoma cells. Mutation and promoter methylation of PTEN gene were responsibility to only part of PTEN gene deficient. Using miRNA array of hepatocarcinoma and hepatocyte cells, we found that hsa-miR-20 was aberrant expression in hepatocarcinoma cells. Sequencing analysis indicated that PTEN might be the target of hsa-miR-20. In the present study, we will explore whether hsa-miR-20 might regulates PTEN gene, hence influences radiosensitivity and progression of hepatocarcinoma. This study may provide novel strategy to improve therapeutic outcome of hepatocarcinoma.

肝癌是我国常见恶性肿瘤，目前对于大多数原发性肝癌患者的治疗选择以放疗和介入治疗为主，如何提高肝癌辐射敏感性是面临的重要问题。我们发现抑癌基因PTEN在肝癌组织/细胞中存在缺失表达，过表达PTEN基因可增加肝癌细胞的辐射敏感性。基因突变和启动子甲基化不能完全解释肝癌中PTEN异常表达原因。经miRNA array技术筛选，我们发现肝癌组织中高表达hsa-miR-20。而软件预测分析显示PTEN是hsa-miR-20的潜在靶基因。本项目拟通过调控hsa-miR-20表达及荧光素酶证实PTEN是hsa-miR-20调控的下游靶基因，并分析下游相关信号通路，从而明确hsa-miR-20通过调控PTEN影响肝癌进展与辐射敏感性，为提高肝癌疗效提供新的科学依据。

miR-20a在肿瘤的发生、发展转移中发挥重要的作用。然而，miR-20a在肝癌辐射抵抗中发挥着什么样的作用，目前尚未有研究报道，本课题的研究目的是探讨miR-20a在肝癌辐射抵抗中所扮演的角色及导致这种作用的机制，为提高肝癌放疗敏感性提供重要理论依据。.研究内容：.1. qRT-PCR检测肝癌细胞株和组织标本中miR-20a及PTEN的表达。.2. Westernblot检测肝癌细胞株和组织中PTEN的表达。.3. 建立稳定过表达miR-20a的肝癌细胞株、细胞辐射及平板克隆形成实验检测细胞辐射抵抗能力变化，Western blot检测相关蛋白的表达水平变化。.4. 生物信息学预测miR-20a下游调控靶基因，并应用双荧光素酶报告系统进一步验证。.5. 细胞辐射及平板克隆实验检测干扰及过表达PTEN对肝癌细胞辐射敏感性的影响。.6. PI3K/AKT通路抑制剂LY294002对肝癌细胞辐射敏感性的影响.7.体内试验观察miR-20a对肝癌辐射辐射敏感性的影响。.结果：.1. miR-20a在肝癌细胞株和组织标本中表达升高，PTEN表达降低。.2. 平板克隆及MTT实验结果显示miR-20a对肝癌细胞体外增殖能力无影响。.3. 平板克隆实验结果显示过表达miR-20a增强肝癌细胞辐射抵抗，反之，沉默miR-20a降低肝癌细胞辐射抵抗.4. Westernblot结果显示稳定过表达miR-20a后，γ-H2AX 及active-caspase表达水平降低，Bcl-2表达水平升高；沉默miR-20a后得到与之相反的结果，提示过表达miR-20a可以诱导肝癌细胞发生辐射抵抗。反之，沉默miR-20a后细胞辐射敏感性增强。. 6. 生物信息学预测及双荧光素酶报告系统实验结果显示PTEN为miR-20a的靶基因。.7. 平板克隆实验结果显示干扰PTEN后肝癌细胞辐射抵抗增强，γ-H2AX和活性的caspase-3表达水平降低，Bcl-2表达水平升高，且 p-AKT表达升高。反之，过表达PTEN，细胞辐射抵抗能力减弱，γ-H2AX和caspase-3表达水平升高，Bcl-2表达水平降低。同时发现过表达PTEN后p-AKT表达下降。.8. 在稳定过表达miR-20a的肝癌细胞中转染过表达质粒pCDNA3.1-PTEN后，细胞辐射和平板克隆实验结果显示细胞辐射抵抗能力减弱，提示PT