丹参酮生物合成关键酶CPS、KSL互作蛋白的分离及功能研究

药用植物有效成分的合成代谢是在一系列关键酶的催化下形成的，这些酶并非孤立的存在于细胞中，而是与其它蛋白相互作用来行驶其功能。丹参柯巴基焦磷酸合酶（SmCPS）和类贝壳杉烯合酶（SmKSL）基因已被鉴定为形成丹参酮类母核的关键酶基因，特别是SmCPS为被子植物中首次克隆得到能产生normal-柯巴基焦磷酸的二萜合酶基因，具有重大的研究价值。为进一步阐释SmCPS和SmKSL的作用机理及深入挖掘丹参酮生物合成的下游基因，本项目从蛋白质相互作用的角度出发，利用酵母双杂交系统筛选与SmCPS、SmKSL互作的蛋白，并通过RNAi基因敲除和正义过表达实验，明确候选基因对SmCPS和SmKSL表达和丹参酮类成分积累的影响，深入解析关键酶之间的相互作用机理，初步构建丹参酮类化合物生物合成的"多酶复合体"模型，进一步解析其生物合成途径。

本项目通过酵母双杂交技术证明了参与丹参酮生物合成的两个关键酶基因SmCPS1和SmKSL1 存在互作关系，两者在丹参根部木栓层特异共表达。这一发现揭示了二萜生物合成中两个紧密相连，并依次发挥功能的二萜合酶基因是形成“复合体”来行驶功能的。此发现证实了我们提出的二萜合酶间“多酶复合体”模型的假想，并为利用合成生物学生产次丹参酮二烯的工作提供了重要的支撑。在此基础上，综合利用转录组、基因表达谱、RNAi干扰以及代谢组学分析等全面阐释SmCPS1和SmKSL1在丹参酮生物合成中的重要性及其基因进化历程。经研究发现，SmCPS1和KSL1是参与丹参根中丹参酮类化合物生物合成的唯一二萜合酶基因，控制着丹参酮类化合物在根部木栓层的合成和积累，基因结构的改变及正选择压力可能是其获得特定功能的分子机制。