橡胶树橡胶生物合成关键蛋白SRPP互作蛋白的鉴定及功能分析

The rubber particle is a special organelle in which natural rubber is synthesized and stored in the laticifers of rubber tree(Hevea brasiliensis).It's well-known that SRPP(small rubber particle protein), which is a major component of rubber particle proteins and specifically expressed in SRP(small rubber particle), involved in natural rubber biosynthesis of rubber tree. SRPP interacting proteins haven't been identified in the rubber tree. Rubber particle proteins constitute a protein complex that plays a role in natural rubber biosynthesis. Latex yeast expressed cDNA library of rubber tree was constructed in our provious work. In this study, SRPP interacting proteins were identified by yeast two-hybrid system and BIFC. Expression pattern of SRPP interacting protein gene was characterized in rubber tree with different yield by real time-PCR. To functionally analyze its role in natural rubber biosynthesis, SRPP interacting protein gene was over-expressed in Taraxacum kok-saghyz.The result will help to elucidate molecular mechanism of natural rubber biosynthesis, and provide important genes for improve rubber yield by biotechnology method.

橡胶粒子是橡胶树进行橡胶生物合成与贮存的场所。已有研究证明小橡胶粒子蛋白(SRPP) 是橡胶粒子蛋白的主要成分，特异表达于小橡胶粒子，与橡胶生物合成密切相关。目前，橡胶树中与SRPP互作的蛋白尚未得到分离鉴定。已有研究证明橡胶粒子蛋白是以蛋白复合体形式在橡胶生物合成过程中发挥作用。因此，在已经构建了橡胶树胶乳的酵母表达cDNA文库的基础上,本项目通过酵母双杂交、双分子荧光互补 (BIFC)等分子生物学与生物化学相结合技术筛选鉴定橡胶树中与SRPP互作的蛋白，分析候选蛋白基因在不同产量橡胶树中的表达差异，同时将候选蛋白基因转化橡胶草分析其对橡胶产量的影响，验证候选蛋白基因在橡胶生物合成过程中的功能，为阐明天然橡胶生物合成的分子机理奠定基础，为通过生物技术手段提高橡胶树的产量提供靶基因。

橡胶粒子是橡胶树进行橡胶生物合成与贮存的场所，橡胶粒子蛋白对橡胶生物合成起着非常重要的作用。小橡胶粒子蛋白(SRPP, small rubber particle protein) 是橡胶粒子蛋白的主要成分，是橡胶生物合成的关键蛋白，决定着橡胶生物合成速率和橡胶树胶乳产量与橡胶质量。目前，橡胶树中与SRPP 互作的蛋白尚未得到分离鉴定。同时橡胶粒子蛋白是以蛋白复合体形式在橡胶生物合成过程中发挥作用。本项目通过酵母双杂交方法筛选和鉴定了SRPP的候选互作蛋白，确认了橡胶延伸因子（REF）、顺式异戊烯基转移酶（HRT2）、真核起始因子（EIF）、硫胺噻唑合成酶( TTS)、类咖啡酰莽草酸酯酶 (CSE)、氨基甲酰磷酸合成酶（CSS）、蛋白酶体亚基（PSB）、生长素结合蛋白(ABP)、含Kelch重复基序的类F-box蛋白(SKIP)、UDP 葡萄糖转移酶（UDP）和60S核糖体蛋白(60S)等11个蛋白与SRPP存在相互作用。拟南芥悬浮细胞的亚细胞定位分析表明，TTS定位于质膜和叶绿体、CSE定位于细胞液、SKIP定位于细胞核。实时荧光定量PCR表达分析结果显示，割胶刺激诱导下，SRPP基因在胶乳中的表达，第六刀表达量最高， REF、HRT2、EIF、CSE、CSS、PSB、SKIP、UDP和60S表达量上调，TTS和ABP表达量下调；乙烯利处理后，REF、SRPP、HRT2基因的表达均呈现先上升高后下降的表达趋势，EIF、TTS 、CSE、ABP、UDP、60S表达量下调，CSS、PSB 、SKIP表达量先下调后上调；茉莉酸(JA)处理对橡胶树SRPP基因及其互作蛋白表达的影响显示， SRPP 、REF 、HRT2基因的表达量均显著升高，其它互做蛋白在处理后均显著低于处理前水平。本项目的研究结果显示SRPP 与REF 、HRT2存在相互作用，在割胶刺激下，SRPP 、REF 、HRT2基因表达量升高，表明SRPP 、REF 、HRT2可能以蛋白复合体形式在橡胶生物合成过程中发挥作用。本研究为解析天然橡胶生物合成的分子机理奠定基础。