神经肌肉突触清除的细胞与分子机制的研究

突触清除是理解突触可塑性研究的重要内容，阐明其发生和产生机制有助于理解突触可塑性和记忆的形成。本研究拟以变态早期果蝇神经肌肉突触为实验体系，采用透射电子显微、激光共聚焦以及电生理技术，通过UAS-GAL4系统和突变体分析方法筛选可能参与神经肌肉突触清除过程的信号通路或分子，以理解细胞凋亡、泛素-蛋白酶体系统及吞噬作用在突触后结构清除中的生理学功能，阐明胶质细胞、吞噬细胞以及神经元自身的溶酶体在突触前结构清除中的作用，发现决定突触前结构清除对突触后结构清除依赖性的信号通路或分子，以揭示神经肌肉突触清除的分子和细胞学机理，为理解突触可塑性和记忆的形成提供新的见解。

本研究利用RNAi敲低技术和突变体分析法针对突触前结构清除、突触后结构清除及突触前结构清除对突触后结构清除的依赖性三个问题进行了系统的遗传学筛选。结果表明9个基因可能参与突触前结构清除，其中包括Ras85D，Rab9F，Rab27，吞噬作用相关基因ATG6、ATG7、ATG8b、ATG12，转录因子eIF4a III、eIF4E；18个基因可能参与突触后结构清除,其中包括溶酶体-吞噬作用相关基因Atg1、Atg2、Atg3、Atg4、Atg6、Atg8a及Atg13，细胞凋亡相关基因Grim、dred、drice，泛素蛋白酶体通路相关基因Prosα4、Prosα5、Prosα7、Prosβ5、Prosβ7、Rpt6、Rpn6、Uba1。系统分析信号分子在突触前后结构清除依赖性中的作用后我们认为依赖性可能是由于突触后结构的完整性产生的，而过表达PTEN、Tor、Rheb、Foxo或抑制Akt、PI3K、InR等细胞生长通路基因延缓突触后清除过程则验证了该可能性。.随后基于筛选结果我们系统解析了吞噬作用在突触后清除过程中的分子机制。利用吞噬相关标记及电镜分析吞噬相关突变体发现吞噬作用被抑制。但在半合子突变体中不能延缓突触清除，提示该信号通路存在冗余性；互作及拯救实验表明ATG基因间存在冗余性。进一步利用凋亡相关标记分析发现细胞凋亡在程度较重的RNAi敲低突变体中被抑制，而在部分突变体中未被抑制，提示凋亡通路可能与吞噬作用平行作用于突触清除过程。利用吞噬相关标记、凋亡相关标记及拯救实验发现细胞生长通路在两者上游通过转录调控参与突触清除过程。总之，本研究进一步解析了突触清除过程的分子调控网络，为理解突触可塑性和记忆的形成提供新的见解。